毒死蜱降解菌株的分离、鉴定及降解条件优化

孟迪,邵璇,侯润兰,曹爱青,李玉洁,刘前程

(商丘师范学院 特色微生物资源开发与应用河南省工程研究中心,河南 商丘 476000)

毒死蜱(Chlorpyrifos,CAS:2921-88-2)是美国陶氏化学公司研制的一种高效、中等毒性的广谱型有机磷杀虫杀螨剂[1].自1965年问世以来,毒死蜱迅速成为全世界生产和销售量最大的杀虫剂品种之一.据统计,毒死蜱的全球需求量以每年10%的速度增长,到2015年,需求量超过200000 t[2].由于毒死蜱水溶解度较低(2.0 mg/L)、土壤吸附系数较高(360-31000)、且在土壤中的半衰期较长(10-240 d),长期不合理的使用对环境和生态系统造成潜在的毒害作用,如:破坏土壤结构和功能、影响土壤微生物的群落结构等[2-6].此外,环境中的毒死蜱可通过呼吸、皮肤接触、食物等途径进入人体并抑制体内乙酰胆碱酯酶的活性,造成生物体中毒[2,7].

环境中残留毒死蜱的处理方式主要包括物理降解、化学降解和生物降解[8].其中,生物降解特别是微生物降解以其具有高效、廉价、无二次污染等优点成为降解毒死蜱的主要方法[5,7].目前,国内外已筛选出多种毒死蜱降解微生物[3,5,9].然而微生物种类不同且降解效率易受环境因子的影响[5,10],因此筛选出高效降解毒死蜱的菌株,并研究不同条件对菌株降解毒死蜱的影响,对菌株在环境中的应用具有重要的理论和实践指导意义.

基于此,本研究以商丘睢县一家废弃的农药厂土壤样品为筛选源,通过富集、分离、纯化等一系列步骤筛选出高效降解毒死蜱的菌株,对其进行分子生物学鉴定并优化其降解条件,为环境中毒死蜱的生物降解提供菌种资源.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品采集

土壤样品采集于河南省商丘市睢县一个废弃十多年的农药生产厂家(纬度:34.43;经度:115.02;海拔:26.21～43.28 m).采集方法参照魏志文[11]中所述.

1.1.2 培养基

富集培养基:3 g 牛肉膏,5 g 蛋白胨,5 g 氯化钠,去离子水1000 mL,pH 7.0-7.2.

LB培养基(g/L):蛋白胨10.0,酵母粉5.0,NaCl 10.0,pH 7.0-7.2.

以毒死蜱为唯一碳源(M-1)培养基、以毒死蜱为唯一磷源(M-2)培养基和以毒死蜱为唯一碳源和磷源(M-3)培养基,配制方法参照孟迪[12]中所述.

1.1.3 试剂与仪器

毒死蜱(Sigma),Taq 酶(TaKaRa),DL2000 DNA Marker(TaKaRa),通用引物27F和1492R由金维智公司合成;液相所用试剂为色谱纯,其他均为国产分析纯.

高压蒸汽灭菌器,培养箱,摇床,ABI Thermal Cycler 2720 PCR仪,Smart View Pro 1100凝胶成像仪,岛津LC-20A高效液相色谱仪.

1.2 方法

1.2.1 毒死蜱降解菌株的筛选

a.富集驯化

称取1 g左右土壤样品至含有毒死蜱的富集培养基中,于30 ℃,180 r/min条件下,7 d一周期,并不断提升培养基中毒死蜱的终浓度(25-200 mg/L)[13].

b.初筛

将富集驯化的菌液,4 ℃,8000×g离心5 min,除去上清,之后用无菌水清洗3次,并用无菌水重悬,分别涂布在M-1、M-2和M-3平板上(毒死蜱浓度为50 mg/L),30 ℃培养并观察.将培养皿上长出的菌落在超净工作台中用接种环以三区划线法接种在新的同种培养基中,反复4次划线,得到较纯的毒死蜱降解菌株[14].

c.复筛

将筛选到的菌株接种至相应的液体培养基(毒死蜱浓度为50 mg/L)中,30 ℃,200 r/min培养7 d,并用高效液相色谱法检测毒死蜱含量,计算出降解效率.以相同条件下不接入菌液但添加等量的相应培养基为对照,培养条件同上,每个样品重复3次[13].

1.2.2 毒死蜱降解菌株的鉴定

根据复筛结果选取高效降解毒死蜱的菌株,并参照朱云鹏[15]中所述的方法提取分离菌株的基因组.以提取的基因组为模板,27F和1492R为引物扩增16S rRNA基因片段,扩增片段在凝胶成像仪下成像观察,并送至金维智公司进行测序.测序完成后进行序列比对,然后构建系统发育进化树.进化树的构建使用MEGA6.0软件,采用邻近法(Neighbour-Joining)并对树的稳定性进行自展值检验(Bootstrap,1000个重复)[16].

1.2.3 毒死蜱降解菌株的降解条件优化

a.不同培养基对降解菌降解率的影响

配制3种不同的培养基M-1、10%LB培养基和LB培养基,毒死蜱终浓度为50 mg/L.取1 mL过夜培养的菌液接种到3种不同培养基中,30 ℃,180 r/min培养7 d.分别以相同条件下不接种菌液但添加等量的相应培养基为对照,上述实验所有处理组和对照组均重复3次.发酵结束后,测定液体培养基中毒死蜱含量并计算降解效率.

b.接种量对降解菌降解率的影响

分别按1%、3%、5%、7%和9%的接种量接种至a中降解效率较高的培养基中,培养基中毒死蜱终浓度为50 mg/L,30 ℃,pH 7,180 r/min培养7 d.分别以相同条件下不接种菌液但添加等量的培养基为对照,上述实验所有处理组和对照组均重复3次.发酵结束后,测定液体培养基中毒死蜱含量并计算降解效率.

c.温度对降解菌降解率的影响

按b中结果接种至a中降解效率较高的培养基中,培养基中毒死蜱终浓度为50 mg/L.不同温度(15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃和35 ℃),pH 7,180 r/min培养7 d.以相同条件下不接种菌液但添加等量的培养基为对照,上述实验所有处理组和对照组均重复3次.发酵结束后,测定液体培养基中毒死蜱含量并计算降解效率.

d.pH值对降解菌降解率的影响

按b中结果接种至a中降解效率较高的培养基中,培养基中毒死蜱终浓度为50 mg/L.培养温度根据c中结果选定,调节培养基的pH值分别为5、6、7、8和9,180 r/min培养7 d.以相同条件下不接种菌液但添加等量的培养基为对照,上述实验所有处理组和对照组均重复3次.发酵结束后,测定液体培养基中毒死蜱含量并计算降解效率.

1.2.4 HPLC检测

样品前处理和液相检测条件参照孟迪[12]液相检测方法.

其中,降解率方程如下:

C:对照中农药含量(mg/L);T:发酵液中农药残留量(mg/L).

2 结果与分析

2.1 菌株筛选

经平板初筛和摇瓶复筛,得到17株毒死蜱降解菌株,包括7个以毒死蜱为唯一碳源(M-1)生长的菌株,5个以毒死蜱为唯一磷源(M-2)生长的菌株,5个以毒死蜱为唯一碳源和磷源(M-3)生长的菌株(图1).由图1可知,M-1中生长的降解菌株对毒死蜱的降解效率显著高于其他两类(M-2和M-3),其中OP1和OP7对毒死蜱的降解效率最高,由于OP1另行研究,本文则选择OP7进行后续研究.

图1 不同菌株对毒死蜱的降解能力

2.2 菌株的鉴定

菌株OP7的16S rRNA序列经PCR扩增、测序、Blast比对后构建系统发育树(图2),发现菌株OP7与粪产碱杆菌Alcaligenesfaecalissubsp.parafaecalis G (AJ242986)位于同一个分支,且相似度高达100%.因此,可将菌株OP7初步鉴定为Alcaligenesfaecalis,并命名为AlcaligenesfaecalisOP7.

图2 基于16S rRNA基因的系统发育树

2.3 培养基类型对菌株降解毒死蜱的影响

如图3所示,培养基类型对菌株OP7降解毒死蜱的影响顺序为10%LB>M-1>LB.可能是OP7在营养丰富的LB培养基中主要进行繁殖,不利用毒死蜱;在贫瘠的M-1培养基中,菌株OP7为了生存利用毒死蜱,而毒死蜱降解菌株可利用的碳源需要复杂的过程,因此降解效率较低;而处于营养适中的10%LB,既能够满足菌株的生长,同时为该菌利用毒死蜱提供足够的时间,因此降解效率最高[5,17].

图3 培养基类型对菌株OP7降解毒死蜱的影响

2.4 接种量对菌株降解毒死蜱的影响

由图4可知,不同的接种量下,菌株OP7对毒死蜱的降解率也不同,但总体表现为先增加后平缓的趋势.当接种量达到3%以后,菌株对毒死蜱的降解效率基本不变.因此,选择3%作为后续实验的接种量.

图4 接种量对菌株OP7降解毒死蜱的影响

2.5 温度对菌株降解毒死蜱的影响

由图5可以看出,随着温度增加菌株OP7对毒死蜱的降解率呈现上升的趋势.研究表明在15-35 ℃的温度范围内,微生物降解毒死蜱的降解效率随温度的升高有的呈现先增后减的趋势,有的呈现上升趋势[5,18-21],这可能是微生物对毒死蜱的降解主要是各种酶促反应[22,23],而菌株OP7的主要降解酶的最适温度可能偏高.

图5 温度对菌株OP7降解毒死蜱的影响

2.6 pH对菌株降解毒死蜱的影响

研究表明,大部分降解微生物对毒死蜱的最适降解pH在6-8之间[3,20,21,24],而菌株OP7对毒死蜱的降解率随pH的增加呈现上升趋势(图6),这可能是一方面较高的碱性条件改变了毒死蜱的形态及生物毒性,从而影响菌株的降解效率[21,25],另一方面是菌株OP7的主要降解酶的最适pH偏高.

图6 pH对菌株OP7降解毒死蜱的影响

3 结 论

本研究从商丘睢县一家废弃的农药厂土壤中分离出一株高效降解毒死蜱菌株OP7,经16S rRNA测序分析,将其鉴定为粪产碱杆菌Alcaligenesfaecalis,并命名为AlcaligenesfaecalisOP7.通过对菌株OP7降解毒死蜱的条件分析,该菌株具有较强的抗逆性,即在较低的营养、较高的温度和pH条件下均能降解毒死蜱,因此在环境中残留毒死蜱的生物修复方面具有应用价值.