人参对自发性糖尿病小鼠的肾脏保护作用及机制研究❋

刘媛媛，刘轶凡，胡 洁，肖 遥，田楚箫，周 楠，傅 强△

(1.北京中医药大学东直门医院，北京 100700；2.北京中医药大学第三附属医院肾病科，北京 100029)

糖尿病肾脏病(diabetic kidney disease，DKD)是糖尿病重要的微血管并发症，我国约有20%～40%的糖尿病患者合并DKD，现已成为慢性肾脏病和终末期肾病的主要原因[1-2]。早期肾脏病变具有可逆性,进入显性蛋白尿期后则发展迅速且不可逆，因此DKD的早期防治尤为重要。现代医学尚无治疗DKD的有效药物，主要通过管理血糖、血压延缓其发展，中医药具有疗效好、副作用小等优点，为DKD的早期防治提供了可能[3]。

人参为五加科植物人参Panax ginseng C.A.Mey.的干燥根，经晒干者称生晒参，经蒸熟并干燥者称红参，有大补元气、生津止渴之效，是临床治疗糖尿病及其并发症的有效药物。研究发现，人参的有效成分具有抗衰老、抗疲劳、调节免疫力等药理作用[4]。炎症与氧化应激被认为是DKD发生发展的重要病理机制，并可进一步激活其他DKD进展相关的机制通路[5-7]，故本研究以此为切入点，观察了人参对自发性糖尿病小鼠糖脂代谢、肾功能、肾脏病理等的影响，旨在探讨其对肾脏保护作用及内在机制，以指导临床治疗。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级8周龄雄性自发性2型糖尿病db/db(C57BLKS)小鼠18只，体质量35～40 g；同周龄雄性同窝野生型db/m小鼠6只，体质量20～25 g，均购自常州卡文斯实验动物有限公司[实验动物许可证号：SCXK(苏2016-0010)]。饲养于北京中医药大学东直门医院SPF级环境屏障动物实验室[SYXK(京)2020-0013]，饲养环境温度为20～26 ℃，日温差≤3℃，相对湿度40%～70%，12 h光/暗周期。常规喂养饲料及饮用水，基础饲料配方：糖水化合物65%、蛋白质24.2%、脂肪10.3%，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供(货号1022)。动物实验方案经北京中医药大学动物福利委员会批准(编号为21-19)，实验期间按照3R原则给予实验动物人道关怀。

1.2 药物

生晒参饮片(产地：吉林)由东直门医院草药房自同仁堂采购并鉴定，依据临床常规煎煮方法，取生晒参3 g(剂量依据预实验确定)置于砂锅中，加蒸馏水500 mL，浸泡30 min，武火煮沸，改文火煎煮45 min，用双层棉纱布过滤；再加入蒸馏水300 mL，武火煮沸，改文火煎煮30 min，过滤后将两次滤液合并浓缩至含生药39 mg/mL，分装后4 ℃保存，每周按上述方法煎煮一次备用。盐酸二甲双胍片(0.5 g/片，中美上海施贵宝制药有限公司，国药准字H20023370)，称取1.5 g盐酸二甲双胍片并粉碎，用蒸馏水配成浓度为19.5 mg/mL的盐酸二甲双胍混悬液，4 ℃储存备用，用时室温放置60 min,振摇使其混匀，每周配置一次。

1.3 试剂及仪器

总胆固醇(total cholesterol，TC)测定试剂盒、甘油三酯(triglyceride，TG)测定试剂盒、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)测定试剂盒、肌酐(creatinine，Cr)测定试剂盒、尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)测定试剂盒、糖化血清白蛋白(glycated serum protein，GSP)测定试剂盒，苏木素-伊红染色液、马松染液、爱先蓝-糖原染液均购自南京建成生物工程研究所(货号分别为A111-1-1、A110-1-1、A113-1-1、C011-2-1、C013-2-1、A037-2-1、D006、D026-1-2、D033-1-1)；尿微量白蛋白试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司(货号：ML063626-2)；丙二醛(glycated serum protein，MDA)比色法测试盒、总超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，T-SOD)比色法测试盒、过氧化氢酶(catalase，CAT)比色法测试盒、白介素1β(interleukin1β，IL-1β)ELISA 试剂盒、白介素6(interleukin 6，IL-6)ELISA试剂盒、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα，TNF-α)ELISA试剂盒均购自武汉Elabscience公司(货号分别为E-BC-K025-M、E-BC-K020-M、E-BC-K031-M、E-MSEL-M0003、E-MSEL-M0001、E-MSEL-M0002)；bx51型光学显微镜，日本Olympus公司；MK3型酶标仪，德国赛默飞世尔仪器有限公司；D1008E型涡旋机，美国SCILOGEX公司；ICV-450型电热恒温培养箱，日本ASONE公司；H1650-W型台式微量高速离心机，湖南湘仪离心机有限公司；RM2135型石蜡切片机，德国Leica公司；EG1140H型包埋机，德国Leica公司。

1.4 分组及给药

18只db/db小鼠随机分为模型组、人参组、二甲双胍组，以6只db/m小鼠为正常组。人参组给予0.39 g/kg生晒参水煎剂灌胃、二甲双胍组给予0.195 g/kg药物混悬液灌胃、模型组、正常组给予等体积蒸馏水灌胃(10 mL/kg)，每日1次，连续灌胃9周。小鼠剂量(g/kg)=9.1×人的临床剂量(g/kg)[8]。

1.5 观察指标与标本收集

观察小鼠的精神状态、活动情况、毛发、饮食、饮水、排便、排尿等情况，每周测量小鼠体质量。取材前使用代谢笼收集各组小鼠6 h尿液，4 ℃ 3000 r/min，离心15 min，计算尿量，取上清液按照试剂盒说明书步骤检测并计算得出尿微量白蛋白与尿肌酐比值(albumin/urine creatinine ratio，ACR)及6 h尿微量白蛋白(six hours urinary total protein，6 h UTP)。灌胃9周后将小鼠处死，处死前禁食水12 h，3%戊巴比妥腹腔注射麻醉后进行摘眼球取血，1200 g离心20 min，收集上清液分装保存于-80 ℃冰箱。摘取肾脏，一半置于4%多聚甲醛中固定，另一半置于冻存管中，-80 ℃冰箱保存。

1.6 肾脏病理学检查

将固定后的肾组织取出，石蜡包埋、切片、进行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin staining，HE)染色、糖原(periodic acid-schiff stain，PAS)染色和马松(Masson)染色，封片后光学显微镜下观察小鼠肾脏病理改变。

1.7 血清指标测定

糖脂代谢指标：甘油磷酸氧化酶法检测小鼠血清TG、TC，双试剂直接法检测LDL-C，果糖胺法测定GSP的表达水平。肾功能指标：肌氨酸氧化酶法检测小鼠血清Cr，脲酶法检测小鼠血清BUN表达水平。氧化应激指标：比色法测定CAT、MDA、SOD的表达水平；炎症指标：酶联免疫吸附法检测小鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 各组小鼠一般情况及体重比较

正常组小鼠毛色光亮，行动敏捷，体型瘦长，活动频繁。模型组、人参组、二甲双胍组小鼠形体肥胖，动作迟缓，活动少，摄食及饮水增多，灌胃后期模型组小鼠出现竖毛，体温偏低，对外界刺激反应迟钝的现象。db/db小鼠灌胃前体质量约40 g，db/m小鼠体质量约25 g。与模型组比较，人参组体质量增长趋势减缓，自第6周起差异有统计学意义(第6、7周P<0.05，第8、9周P<0.01)。人参组与二甲双胍组无差异无统计学意义。见图1。

注：人参组与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01

2.2 尿蛋白指标变化

如表1所示，与正常组比较，模型组尿蛋白显著升高(P<0.01)。与模型组比较，人参组ACR、6 h UTP显著下降(P<0.01)。二甲双胍组6hUTP显著下降(P<0.01)，ACR有下降趋势，但差异无统计学意义。人参组与二甲双胍组比较，差异无统计学意义。

表1 各组小鼠尿蛋白水平比较

2.3 肾脏组织病理形态变化

小鼠肾脏HE染色结果显示：正常组肾脏组织结构大体正常，肾小球未见明显增大，系膜细胞、系膜基质、肾小囊未见明显异常，肾间质未见明显异常及纤维化。模型组与正常组比较，肾小球肥大明显，毛细血管袢扩张充血严重，系膜细胞增殖，系膜基质扩张，肾小囊变窄，肾间质严重充血水肿，纤维组织增生，可见大片严重的炎细胞浸润。与模型组比较，人参组及二甲双胍肾小球肥大较轻，毛细血管袢扩张充血，系膜细胞增殖，系膜基质扩张，肾小囊变窄较小，见图2。

小鼠肾脏PAS染色结果显示，正常组毛细血管袢扩张，系膜基质正常。模型组系膜细胞增殖，系膜基质扩张，肾小囊变窄。与模型组相比，人参组和二甲双胍组系膜细胞增殖，系膜基质扩张较轻，见图2。

注：苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining，HE)、糖原染色(periodic acid-schiff stain，PAS)；HE：A1正常组、B1模型组、C1人参组、D1二甲双胍组；PAS：A2正常组、B2模型组、C2人参组、D2二甲双胍组

小鼠肾脏Masson染色结果显示：正常组纤维化增生不明显，模型组纤维化增生明显。与模型组相比，人参组和二甲双胍组纤维化程度较轻，见图3。

注：马松染色(Masson)A3正常组、B3模型组、C3人参组、D3二甲双胍组

2.4 糖脂代谢指标变化

如表2所示，与正常组比较，模型组TG、TC、GSP均有显著升高(P<0.05)，LDL-C有升高趋势，但差异无统计学意义。与模型组比较，人参组TC、TG显著下降(P<0.01)，GSP明显降低(P<0.05)，LDL-C有下降趋势，但差异无统计学意义。二甲双胍组TG显著下降(P<0.01)，TC、GSP、LDL-C均明显下降(P<0.05)，人参组与二甲双胍组差异无统计学意义。

表2 各组小鼠血脂及血清白蛋白水平比较

2.5 肾功能指标变化

如表3所示，与正常组比较，模型组BUN显著升高(P<0.05)，SCr升高，但差异无统计学意义。与模型组比较，人参组和二甲双胍组BUN、SCr均明显下降(P<0.01)，但两组间差异无统计学意义。

表3 各组小鼠肾功能水平比较

2.6 氧化应激指标变化

如表4所示，与正常组比较，模型组SOD、MDA均显著升高(P<0.05)，CAT显著下降(P<0.05)；与模型组比较，人参组SOD、MDA显著下降(P<0.01)，CAT显著升高(P<0.05)；二甲双胍组SOD、MDA显著下降(P<0.01)，CAT显著升高(P<0.01)，人参组与二甲双胍组差异无统计学意义。

表4 各组小鼠血清氧化应激水平比较

2.7 炎症指标变化

如表5所示，与正常组比较，模型组血清炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α均显著升高(P<0.05)。与模型组比较，人参组IL-6、IL-1β、TNF-α均显著下降(P<0.01)，二甲双胍组IL-6、IL-1β显著下降(P<0.01)，TNF-α下降明显(P<0.05)，人参组与二甲双胍组差异无统计学意义。

表5 各组小鼠药物血清炎症指标水平比较

3 讨论

国医大师吕仁和教授认为，DKD是由于消渴病(糖尿病)内热伤阴耗气，日久损及肾络，痰湿瘀诸邪邪胶结形成“微型癥瘕”，致肾体受损，肾用失司[9]。气虚是贯穿以上病理过程的关键病机，故益气法是贯穿治疗始终的关键治法。人参作为治疗消渴病益气药物的代表，可补五脏之气，生津液、安精神。《名医别录》还记载人参有“止消渴，通血脉，破坚积”的作用。本团队早期临床研究发现，以人参、黄连为主要成分的“三黄安消胶囊”具有明显的降血糖、降血脂、降血压的效果[10]。前期依托国家自然科学基金课题研究发现，人参、黄连药对可以起到调节肠道菌群、改善胰岛素抵抗的作用[11]。可见，人参在2型糖尿病及其并发症的防治中的关键药物，但人参单味药防治DKD的研究相对不足。本研究对人参对糖尿病动物模型的药效学进行评价，并从氧化应激及炎症反应角度探究在人参保护肾脏的内在机制。

实验选用db/db小鼠，具有极度肥胖、多食、多饮、多尿等糖尿病典型临床症状，是研究2型糖尿病及其并发症的理想模型。其存在显著的糖脂代谢紊乱，约在16周龄左右可见明显的蛋白尿及肾小球滤过率的轻度下降，与人类的肾脏疾病病理改变相似，可出现肾小球肥大、系膜基质扩张等多种病理变化[12]。本研究中，模型组18周龄的db/db小鼠出现了显著糖脂代谢异常，GSP、TC、TG、LDL-C显著升高，并出现了显著的蛋白尿和血肌酐的轻度升高，其肾脏病理改变符合，与文献报道基本一致。研究首先从糖脂代谢、尿蛋白、肾功能等方面对人参药效学进行了评价。其中由于db/db小鼠随机血糖波动较大，故选用GSP以反映机体2～3周的血糖代谢情况，有较强的敏感性和稳定性[13]。经人参干预后，反应糖脂代谢的GSP、TG、TC、LDL-C均显著改善，效果与二甲双胍相近，反映人参具有良好的调节糖脂代谢的作用。在尿蛋白方面，人参干预后显著下降了ACR、6hUTP，提示人参对肾小球滤过膜损伤具有一定保护作用。在肾功能方面，db/db小鼠SCr具有上升趋势，但尚无显著差异，可能与肾脏损伤尚不严重，仍具有一定的代偿功能有关。但经人参干预后，BUN、SCr显著下降，病理染色所见肾脏病理改变较模型组明显减轻，纤维化减少，说明人参具有保护肾功能的作用，这也印证了气虚对消渴病进展的影响。

机体的SOD活性、MDA和CAT含量是表征氧化应激水平的常用指标。研究表明，在2型糖尿病的动物模型中，常出现SOD、CAT下降，MDA升高等氧化应激表现。由于胰岛B细胞SOD、CAT水平下降且活性较低，ROS可以直接损伤胰岛B细胞，ROS还可以作为细胞内信使，通过多种途径诱导内皮细胞和足细胞损伤及凋亡，诱发肾脏炎症，引起肾损伤、蛋白尿产生[14]。炎症因子在DKD中起着重要的作用，常见的炎症因子如IL-6、IL-1β、TNF-α等，在疾病中往往都呈现升高趋势，大量炎症因子聚集在肾脏中，一方面可以激活NF-κB通路，加重炎症反应，另一方面导致ROS增加，进一步加重氧化应激反应[15-17]。本研究从氧化应激与炎症角度初步探究人参的起效机制，可观察到人参提升了抗氧化防御体系中关键酶SOD、CAT的水平，下降了反映氧化损伤程度的MDA，起到良好的抗氧化能力。除此之外，通过人参干预后，db/db小鼠的IL-6、IL-1β、TNF-α均下降，说明其具有抗炎症反应的重要作用。部分研究表明，人参的活性成分如人参皂苷Rg1、人参皂苷CK能够改善血清氧化应激指标、下调炎症因子，增强肾组织抗氧化能力，增强机体抗疲劳能力，与本研究结果具有一致性[18-20]。

本研究采用二甲双胍作为阳性药物对照，二甲双胍为2型糖尿病一线用药，研究证实其具有抗炎、抗氧化应激、保护肾功能的作用[21-23]。中药人参在药效学方面，与二甲双胍改善炎症、氧化应激方面的作用大致相似，但研究中采用剂量为前期实验确定的动物最佳剂量，相当于临床剂量的3 g，相信通过适当配伍和调节剂量，其疗效能进一步提升。诚然，本研究在药效学外，仅对其作用机制进行了初步探讨，这有待于后续深入研究。

综上所述，人参可以通过改善炎症与氧化应激，调节糖脂代谢，发挥对自发性糖尿病小鼠的肾脏保护作用，本研究为临床应用人参防治DKD提供了一定科学依据。