牡丹花蕊蛋白对面团和面筋蛋白特性的影响

罗 磊，夏迎利，杨浩昆，赵一帆，李瀚姝，马 潇

（河南科技大学食品与生物工程学院，河南省农产品干燥装备工程技术研究中心，河南 洛阳 471000）

牡丹花色泽艳丽，素有“花中之王”的美誉，我国自古就有食用牡丹花的习惯，现已形成多种地方特色名吃，如牡丹鲜花饼、牡丹花银耳汤等[1]。2013年丹凤牡丹被国家卫生部列为一种新资源食品原材料，被众多研究者开发与利用。

我国牡丹种植面积已超过30万 亩，除具有极高的观赏价值外，花期过后其籽可产油，根皮可入药，花瓣宜食用，而牡丹花蕊由于没有得到很好的开发，出现大量资源浪费的现象。牡丹花蕊是牡丹之精华，碳水化合物和蛋白质含量高，脂肪酸构成较健康，能降低人体血压，具有较好的抗氧化效果，对人体生理代谢以及膳食结构的调节具有重要作用。研发者应加大对牡丹花蕊功能成分、加工特性以及食品开发方面的研究，为牡丹花蕊资源进一步开发利用提供依据，有利缓解资源浪费的局面。

近年来，国内外众多研究者发现将植物蛋白添加到面粉中可以提高面制品的营养品质，改善面团的特性，影响面筋网络结构，从而可以提高面制品的质量[2-3]。大豆蛋白是一种高纯度蛋白，因其产量高、价格便宜、营养丰富，常被作为食品改良剂应用于肉制品、面制品、乳制品等食品中[4]。有研究表明，将大豆分离蛋白（soy protein isolate，SPI）添加到面粉中，蛋白质和面筋蛋白含量显著增高，面条口感较好，断条率明显减少。在生产面包时加入不超5%的SPI可改善面包表皮色泽，增大面包体积，增加风味，营养增补效果明显。应用于饼干生产时，可提高其保水性，延长产品货架期[5]。牡丹花蕊作为药食同源的植物原料，蛋白质含量占干质量的23.73%，氨基酸组成合理，其中必需氨基酸占比为38.26%，是优质的蛋白质资源[6]。因此，本实验以SPI添加量作比较，研究牡丹花蕊蛋白对面团质构和动态流变学特性影响以及对面筋蛋白二硫键含量、表面微观结构、二级结构等特性的影响，为牡丹花蕊蛋白在面制品开发应用提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牡丹花蕊：丹凤，采自洛阳牡丹园；小麦粉（标准粉：蛋白质质量分数10.07%，水分质量分数13.58%）一加一天然面粉有限公司；SPI 源叶生物科技有限公司；L-半胱氨酸 天津市光复精细化工研究所；乙二胺四乙酸 天津市凯通化学试剂有限公司；甘氨酸上海蓝季生物公司；5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)合肥博美生物科技有限公司；β-巯基乙醇 上海麦克林生化科技有限公司。

1.2 仪器与设备

SMS TA.XT Epress Enhanced食品物性分析仪 美国Stable Micro Systems Ltd.公司；VERTEX70傅里叶变换中远红外光谱仪 德国Bruker公司；DHR2流变仪 美国TA仪器有限公司；TM3000台式电镜 日立高新技术公司；DSC-1型差示扫描量热仪 瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司；T6新世纪紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

1.3.1.1 面团的制作

以小麦粉质量为基准，参考韩畅等[7]的方法略作修改，将牡丹花蕊粗蛋白粉末和SPI分别按照0%、2%、4%、6%、8%、10%的比例与小麦面粉混合均匀，称取适量面粉于揉面机内，加入65%蒸馏水，充分搅拌均匀后，将面团用保鲜膜包好，置于4 ℃冰箱储存备用。

1.3.1.2 面筋蛋白的制备

参考冯勇等[8]的方法稍作修改，采用手洗法进行面筋蛋白的洗涤。分别称取小麦面粉0%、2%、4%、6%、8%、10%的花蕊蛋白和SPI与面粉混合均匀，加入65%蒸馏水混合揉成均匀面团，在室温下静置20 min，然后用蒸馏水反复水洗，期间要注意及时换水以利于洗涤效率高，洗至水澄清遇碘不变蓝即得到面筋蛋白。然后将其进行冷冻干燥处理，得到干燥的面筋蛋白放置自封袋4 ℃冰箱贮存备用。

1.3.2 面团质构性质的测定

利用食品物性分析仪对面团质构性质进行测定，测定前将面团制作为边长为1.5 cm的正方体，选择P/36R圆柱形探头，测试前速率为2.0 mm/s，测试中速率为1.0 mm/s，测试后速率为1.0 mm/s，压缩比为50%，触发力为5.0 g，两次压缩间隔为5 s，数值精确到0.01。

1.3.3 面团流变学特性的测定

称取适量面团，放置流变仪平台上，参考杨勇等[9]的方法略有改动。采用频率扫描模式研究牡丹花蕊蛋白和SPI对面团动态流变学的影响。选用直径为40 mm的平板，下降平板至1050 μm，刮去平板外多出的样品，然后下降至剪切间隙为1000 μm，设置平台温度25 ℃，应变量1.0%，扫描频率为1.0～10.0 Hz，测定储能模量（G’）和损耗模量（G”）的变化。

1.3.4 面筋蛋白微观结构分析

参照Gómez等[10]的方法略有修改。将冷冻干燥后的面筋蛋白，使其自然断面，用镊子选出大小合适、样品表面平整的样品，用导电胶带把样品固定在电镜样品台，然后放置喷金仪上进行喷金处理使样品导电，将处理好的样品置于扫描电子显微镜下，调节最佳视野和放大倍数进行观察并拍照。

1.3.5 面筋蛋白二级结构分析

采用傅里叶变换中远红外光谱仪进行面筋蛋白二级结构分析。参考马薇薇等[11]的方法略作修改，取样品1 mg与干燥KBr 100 mg充分研磨，用压片机压成透明或均匀半透明的薄片，在4 cm-1分辨率下进行扫描测定，扫描波段为4000～400-1对每个样品扫描32 次。用Omnic8.2和Perkfit4.0软件选取酰胺I带、基线校准、卷积处理、二阶导数拟合、多次拟合等，通过计算峰面积确定各二级结构的相对含量。

1.3.6 面筋蛋白巯基和二硫键的测定

参考张莹莹等[12]的方法略有改动。Ellman试剂：将20 mg 5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)溶于5 mL Tris-Gly缓冲液中，配制0.2 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 8.0，尿素8 mol/L，1% SDS和3 mmol/L EDTA），混合均匀后，配制成2 mmol/L的L-半胱氨酸标准溶液，梯度稀释为0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mmol/L和0.06 mmol/L的标准溶液。分别取4 mL标准溶液加入0.1 mL的Ellman试剂，混合均匀，在室温下进行显色反应20 min后，以等量蒸馏水替代标准溶液作为空白对照，在412 nm波长处测定吸光度并绘制标准曲线。

游离巯基含量测定：分别称取不同添加量面筋蛋白0.05 g，使其溶解于10 mL 0.2 mol/L Tris-HCl缓冲液中，反应30 min后，在8000 r/min离心20 min，收集上清液。分别取4 mL标准溶液加入0.1 mL的Ellman试剂，混合均匀，在室温下进行显色反应20 min后，以蒸馏水替代样品作为空白对照，在412 nm波长处测定吸光度，根据绘制的L-半胱氨酸标准曲线计算得到面筋蛋白中的游离巯基含量。

二硫键含量测定：取测定游离巯基中离心后的上清液1 mL，加入4 mL的0.2 mol/L Tris-HCl缓冲液和0.1 mLβ-巯基乙醇充分混匀，在25 ℃水浴锅内保温1 h，再加入10 mL的12%三氯乙酸溶液，混匀后继续在25 ℃水浴锅内保温1 h，8000 r/min离心20 min后取沉淀，并用三氯乙酸清洗沉淀3 次。加入10 mL 0.2 mol/L Tris-HCl缓冲液使其复溶，然后加入0.1 mL的Ellman试剂，在室温下进行显色反应20 min后，以蒸馏水替代样品作为空白对照，在412 nm波长处测定吸光度，根据绘制的L-半胱氨酸标准曲线计算得到面筋蛋白中的总巯基含量。

面筋蛋白二硫键含量按下式计算：

式中：SHT为总巯基含量/（μmol/g）；SHF为游离巯基含量/（μmol/g）。

1.4 数据处理

实验数据采用SPSS statistics 23进行显著性分析，运用Excel 2019对数据进行统计分析，利用Origin 8.5软件作图，用Omnic 8.2和Perkfit4.0进行二级结构图谱分析，每组样品做3 次平行实验。

2 结果与分析

2.1 面团质构性质分析

如表1所示，SPI和牡丹花蕊蛋白不同添加量对面团质构的影响规律基本一致，都是随着添加量增加面团的硬度、黏着性、咀嚼性和回复性增加。当牡丹花蕊蛋白添加量为6%时，面团硬度、黏着性、咀嚼性比同量添加SPI分别高了20.73、17、42.93 g，说明与添加相同低量SPI相比，牡丹花蕊蛋白对提高面团特性效果较明显，而弹性、内聚性、回复性与SPI相比差距不大。弹性和内聚性逐渐降低，尤其是添加量超过6%时，加入花蕊蛋白的面团弹性下降较明显，导致下降的原因可能是添加蛋白限制了麦谷蛋白间二硫键的连接，使面筋功能特性受到破坏，内部结构变得致密[13-15]。

表1 牡丹花蕊蛋白和SPI添加量对面团质构性质的影响Table 1 Effects of addition of peony stamen protein or SPI on texture properties of dough

2.2 面团动态流变学特性分析

如图1、2所示，添加牡丹花蕊蛋白和SPI对面团流变学特性G’和G”的影响有相同规律，随着蛋白添加量增加，G’和G”不断上升。在相同频率下，当蛋白添加量不超过6%时，牡丹花蕊蛋白对面团G’和G”的影响与大豆SPI对面团影响相接近，这与面团质构结果一致。原因可能是添加低量蛋白时，促进了面团中面筋蛋白相互作用生成新的交联结构，面筋蛋白网状结构加强，使面团呈现较好的黏弹性[16-17]。图中随着牡丹花蕊蛋白添加量的增加，tanδ先增加后减小，当取代量为4%时，tanδ达到最大值，说明面团的黏性越大，而添加SPI的面团，tanδ不断减小。随着频率的不断升高，图1、2中的tanδ均呈先下降后上升的趋势。这说明在低频率下混合面团的黏弹性较好，随着频率的不断增高，黏弹性比迅速增大，说明在高频率下混合体系结构不稳定，相对更容易遭到破坏[18]。

图1 牡丹花蕊蛋白对面团动态流变学特性的影响Fig.1 Effect of peony stamen protein on the dynamic rheological properties of dough

图2 SPI对面团动态流变学特性的影响Fig.2 Effect of SPI on dynamic rheological properties of dough

2.3 面筋蛋白微观结构观察分析

从图3、4可以看出，没加蛋白质的面筋蛋白表面气孔完整、光滑、连续性较好，孔洞数量较多且大小均匀，但是孔洞较浅，持气能力较弱。随着两种蛋白添加量增加，面筋蛋白的气孔直径逐渐增加，气孔数量多且孔洞加深。当蛋白添加量为6%时，与SPI面筋蛋白微观结构相比，含花蕊蛋白的面筋蛋白气孔数量多，洞壁较薄，连续性较好。这说明花蕊蛋白与面筋蛋白相互作用的能力大于SPI，使得麦醇溶蛋白通过非共价键和麦谷蛋白结合，促进面筋网络结构的形成[19]。随着添加量继续增加，可以发现两种面筋蛋白的有序性明显减弱，与对照组相比较表面的光滑度和均匀度变差，孔径变大、断裂、孔洞壁变厚使面筋蛋白结构变得松散。尤其是牡丹花蕊蛋白的添加量达到10%时，面筋蛋白内部结构完全受到破坏，原因可能是添加的蛋白质吸水性较强，加入较多蛋白质会与面筋蛋白竞相吸水，从而不利于面筋蛋白空间网络结构的形成[20]，石长硕等[21]研究也证实了添加过量大豆蛋白会弱化谷朊粉中面筋蛋白的网络结构，与本实验研究结果一致。

图3 牡丹花蕊蛋白添加量对面筋蛋白微观结构的影响Fig.3 Effect of peony stamen protein on the microstructure of gluten proteins

图4 SPI添加量对面筋蛋白微观结构的影响Fig.4 Effect of SPI on the microstructure of gluten proteins

2.4 面筋蛋白二级结构分析

如图5所示，在3100～3500 cm-1处有吸收带，添加牡丹花蕊蛋白和SPI与对照组相比都发生了红移，这是碳水化合物结合O—H伸缩振动吸收，与分子间氢键的连接相关[22]。从图5可以看出，在2900～3000、1600～1700 cm-1和1510～1500 cm-1均出现了吸收峰，并且位置发生偏移，说明添加蛋白质对面筋蛋白产生影响，酰胺I带（主要为C＝O的伸缩振动，1600～1700 cm-1）中包含α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲结构等信息，因此，常用来对蛋白质的二级结构进行解析[23]。从表2可以看出，当花蕊蛋白添加量为6%时α-螺旋相对含量达到了最大值，相比空白组增加了10.24%，而添加SPI的α-螺旋相对含量不断增加，添加量为10%时比空白组增加了19.52%。β-折叠和β-转角结构所占比例随着牡丹花蕊蛋白添加量增加先减少后增加，而随着SPI的增加呈现下降的趋势，原因可能是蛋白质有很强的吸水性，使得体系中的自由水不断减少，导致面筋蛋白中的氢键被破坏[24-25]。无规卷曲结构会使蛋白构象不稳定，花蕊蛋白的加入呈现无规律，SPI添加的面筋蛋白中含量在不断上升，则说明添加过量蛋白会破坏面筋蛋白的网络结构的稳定性。随着蛋白添加量增加，含花蕊蛋白的面筋蛋白二级结构主要从β-转角变成β-折叠，而加入SPI的面筋蛋白二级结构从β-折叠变成α-螺旋。花蕊蛋白和SPI添加量为6%时，α-螺旋＋β-折叠的占比达到最大值，分别为59.32%和61.95%，α-螺旋和β-折叠都是相对稳定的结构，有利于提高面制品的硬度和弹性[26]，这与前面研究面筋蛋白表面微观结构结果一致。

图5 不同牡丹花蕊蛋白和SPI添加量的面筋蛋白红外光谱图Fig.5 Infrared spectra of gluten proteins added with different amounts of peony stamen protein or SPI

表2 牡丹花蕊蛋白和SPI添加量对面筋蛋白二级结构的影响Table 2 Effects of addition of peony stamen protein or SPI on the secondary structure of gluten proteins

2.5 面筋蛋白巯基和二硫键的测定分析

如表3所示，两种蛋白对面筋蛋白二硫键影响基本一致，但SPI略好于牡丹花蕊蛋白。随着添加量增加，游离巯基含量先下降后上升，而总巯基和二硫键含量呈现先增加后下降趋势，这是因为二硫键和巯基可通过氧化还原实现相互转化。当添加量为6%时，加入花蕊蛋白和SPI二硫键含量与对照组相比分别增加了1.98 μmol/g和3.24 μmol/g，添加适量蛋白质可促进面筋蛋白中的二硫键形成，维持空间结构的稳定性。二硫键会使蛋白质肽键间相互交联，增加其机械强度和硬度，这可能是造成面团中硬度不断增加的原因之一。加入过量蛋白时，二硫键含量减少，这可能也是导致面团弹性降低的主要因素之一，对应的游离巯基含量不断增加，与添加6%时分别增加了2.84 μmol/g和1.75 μmol/g，花蕊蛋白影响较大的原因可能是还原性相比SPI较强，使游离巯基形成过多，但游离巯基会使面筋的网络结构弱化，降低了面筋的网络结构性[27-28]。整体来说，适量添加牡丹花蕊蛋白可维持面筋蛋白空间结构的稳定性。

表3 牡丹花蕊蛋白和SPI添加量对面筋蛋白巯基和二硫键含量的影响Table 3 Effects of addition of peony stamen protein or SPI on the contents of sulfhydryl and disulfide bonds in gluten proteins

3 结论

牡丹花蕊蛋白能够明显提高面团的硬度、黏着性和咀嚼性，添加量低于6%时效果优于SPI，而弹性、内聚性、回复性与SPI相比差距不大。流变性研究表明，添加蛋白提高了面团G’和G”，当花蕊蛋白添加量为4%时，面筋蛋白tanδ达到最大值，面团的黏性较大。低添加量花蕊蛋白和SPI混合面团都表现出较好的黏弹性。

扫描电镜显示，添加花蕊蛋白能够改善面筋网络结构，添加量为6%时网络结构连续性最好，气孔数量多且孔洞深，改善效果略好于SPI。添加花蕊蛋白和SPI能够促使面筋蛋白稳定性差的β-转角转化为结构稳定的α-螺旋和β-折叠，添加量为6%时，α-螺旋＋β-折叠占比达到最大值，分别为59.32%和61.95%。花蕊蛋白添加量为6%时，面筋蛋二硫键含量达到最高，与空白组相比提高了89%，SPI对二硫键含量的影响略优于花蕊蛋白。