源于白鹤球虫新种分子鉴定

王 艳，张志忠，徐前明

（1.合肥野生动物园 230031；2.安徽农业大学动物科技学院 230036 ）

白鹤是濒危灭绝的动物之一，因其对环境适应能力较差,不能适应于人类经济活动导致的生存条件剧烈变化。因此, 野外白鹤数量正在急剧减少。根据国际鹤类研究中心发布的数据,60年代初期有几千只白鹤，而到了1978年全世界只剩下两百多只。国际生物学界认为白鹤濒临灭绝, 将白鹤收录在《红皮书》中作为警示。

球虫病﹑血液原虫病是导致白鹤大批死亡的主要疾病。我国禽类感染球虫较为常见，野生禽类也较为普遍，但白鹤发生该病较为少，白鹤球虫在国内外报道资料不为常见，累积资料较少，尚无详尽统计资料给予描述ITS基因在球虫虫种鉴定上的应用。本次对所分离的白鹤球虫进行鉴定，以便为白鹤球虫分类奠定基础。

1 材料与方法

1.1 病例来源

采集粪便样品来自合肥野生动物园救助野生白鹤。

1.2 细胞与载体

提供自安徽农业大学动物科技学院寄生虫实验室的大肠杆菌DH5α；从TaKaRa公司购买的pMD-19T载体。

1.3 主要仪器

PCR仪（Applied Biosystems公司）；DYY-6C型电泳仪（北京市六一仪器厂）；全自动凝胶成像分析仪（上海培清科技公司，型号JS680D）；DHP恒温培养箱（上海实验仪器厂有限公司,型号XMT-A7000）；冷冻高速离心机（赛默飞世尔科技）。

1.4 主要试剂

琼脂糖，SDS和Tris碱（均购自北京鼎国生物技术有限公司）；Blood DNA kit（上海索莱宝生物科技有限公司）；胶回收试剂盒（QIAGEN公司）；营养琼脂培养基（购自上海瑞楚生物科技有限公司）；普通肉汤（上海乔羽生物科技有限公司）；实验室提供的鲜血营养琼脂平板。PCR扩增所用试剂：TaqDNA聚合酶﹑PCR缓冲液﹑MgCl2﹑dNTPs﹑DNA Maker DL2000﹑蛋白酶K均为TaKaRa公司产品。姬姆萨染料（购自Sigma公司）。

2 方法

2.1 PCR扩增目的基因

2.1.1 球虫卵囊分离与纯化

从合肥市野生动物园收集白鹤粪便，按照张龙乐等【2】报道的方法，采用饱和食盐水漂浮法进行球虫卵囊分离与纯化。

2.1.2 DNA提取

第一，将上述收集的1×105个球虫卵囊用玻璃珠打碎，加入300μL细胞裂解液和20μL蛋白酶K作用4h，再向每管再加入酚和氯仿各200μL，小心颠倒混匀几下。13000 rpm 离心13 min。转移上清至新管。

第二，加入600μL氯仿：异戊醇(24:1)，震荡10s，14000rpm离心3min。

第三，取上清液至新管，再向该EP管中加入2倍体积即200μL的无水乙醇。

第四，在-20℃的冰箱中冷冻保存30min。13000rpm 离心13min。丢弃上清。

第五，加入500μL的75%乙醇注入EP管中，轻轻地转上几下，清洗下EP管，然后去掉液体。

第六，干燥箱内干燥20min。

第七，加入30μL的TE缓冲液，来回吹打几次即可，所提取的基因组用于PCR反应。

2.1.3 引物的设计

根据GenBank.U88565用Primer5.0设计一对引物，预计扩增的片段为539bp，引物由华大基因生物技术有限公司合成。

2.1.4 PCR扩增目的基因

取根据模板的编号进行相应编号的EP管按照下面的体系加样：

mix（Taq酶和dNTP） 12.5µl上下游引物 各1µl DNA模板 1µl dd水 9.5µl Total 25µl

PCR反应参数如下：预变性：94℃ 5min；变性：94℃45s；退火：56℃ 30s；复性：72℃ 30s；进行35个循环，完成后在72℃ 延长10min，于4℃下保存。

2.1.5 琼脂糖电泳检测PCR扩增产物

将PCR产物经琼脂糖凝胶电泳（100V，40min）后，全自动凝胶成像仪分析并拍照。

2.2 PCR产物的纯化

按照回收试剂盒回收PCR产物。

2.3 重组质粒PMD19-T- ITS-1的构建

2.3.1连接PCR产物与T载体

连接体系如下：

PMD-19T 1µl SolutionⅠDNA回收片段ddH2O5µl 3µl 1µl总体积 10µl

短暂离心后于4℃下保存过夜。

2.3.2 转化

方法步骤如下：

第一，10µL连接产物与100µL感受态细胞混匀后，冰上作用30min。第二，然后42℃作用90s。第三，加入1µLLB培养基，180r /min振荡培养1h。第四，12000 r/min离心20s，去掉800µL，剩余的用涂棒均匀涂布在Amp平板上，放置10min后，倒置恒温培养16h。

2.3.3阳性菌的克隆鉴定

用灭菌的枪头从平板上挑取4个单菌落，置入灭菌的LB培养基中培养（含50μg/ ml Amp）至饱和。然后采用菌落PCR方法对其鉴定。

2.3.4基因的测序与比对

将经PCR鉴定为阳性的克隆送至上海生物工程公司进行测序鉴定，测定的序列经NCBI中Blast工具进行序列比对，同时采用DNAstar软件对其抗原性进行分析。

3 结果与分析

3.1 卵囊分离结果

图1 白鹤球虫卵囊形态特征（400×）

将所得球虫进行孢子化试验（置入2.5%重铬酸钾溶液，28℃），发现该球虫最早孢子化时间约为23h。对其卵囊形态观察，其大小约为16-18μm×8-12μm，孢子化后4个孢子囊，每个孢子囊中含有2个子孢子。在外形上，一端窄，一端稍顿，无极孔和极冒等结构。初步判定属于艾美耳球虫属。

3.2 PCR扩增目的基因结果

用自行设计并由华大基因生物技术有限公司合成的一对引物，分别扩增该粪便基因组DNA，得到PCR产物，将产物用1%琼脂糖凝胶电泳后，参照2000 DNA Marker 标记，在500～750 bp间出现一条DNA特异性条带，与预期在539bp相符，没有非特异性条带出现，扩增成功，琼脂糖凝胶电泳图：

图2 PCR扩增结果

3.3 ITS-1基因序列测定结果

CGGcCAGTGcCAaGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATTTTGGTCAGGAAGTTACTTAAATAGAGCCCTCTAAAGGATGCAAAACTCGTAACACGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTCACACTTGTTCGAAATGATAATGGAATGGATCTTCCTTATCGATTTCGGATGATTTCCCACCGCATTGTATCAATCATTGAATCCGTGGCGTCTGCATGCATGGATTGGTGGCCGGCCCATCCGTGCATACCAATGGGATCATATGGATATTCACCCCACAAAGGTTTCTCTTTTTTATTTAAAGCTTAACTACTACTGCATATATACGGCGATTTGCGCAAAATGAGGAGCCGCATGCGGGTCGGCATGCAGCCCCGGGCAGTGGGGCATTGCACGGCGGCGAGGATGTGACCTTGTGTCACTTCGCTCCCCGGGCAAACATCGTTATGAAATCGCGATCTATATACCCACGGGTATTATGTTGTATGTTATTTTAAAAACTTTTTACAATGGATGTCTTGGCTCGTGCAT

所得基因经华大生物公司测序，所得序列长度为539bp，其中G+C含量为48.2%，A+T含量为51.8%。

3.4 序列同源性分析

将测序结果与GenBank中其他分离株基因序列进行了序列比对，结果发现，该分离株的基因与其他毒株的核苷酸同源性均在96%以上，由绘制的进化树分析可知，该分离株与艾美球虫属（A株）（登录号为MF356556.1）亲缘关系最近，与其他分离株的核苷酸同源性为77%～96%.

3.5 ITS-1基因遗传进化树分析

由图3可知，采用Mage软件分析，运用最大简约法计算白鹤球虫（Grane eimeria）ITS-1与所报道的E. gruis在遗传距离上最为接近，而与其他球虫不在同一分支上，且离隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）遗传距离差距最大。

图3 所得基因遗传进化树分析结果

4 讨论

4.1 白鹤球虫种类鉴定

根据临床资料及实验室检验结果， 本园白鹤发生的疫病主要为球虫感染所致。根据形态学鉴定，采用孢子化时间测定，卵囊指数和卵囊大小，外形特征和内部结构。所测的指数与鸡球虫均不完全相同，与孔雀球虫也不一致。与万雪﹑刘冰许等报道丹顶鹤球虫种类也不一致，他们发现丹顶鹤球虫大小为卵囊大小约为18μm ×16μm，这种球虫宽度明显大于本次发现的球虫宽度，其外形是宽椭圆形，而本次发现白鹤球虫是长椭圆形[3，4]。采用分子生物学鉴定方法，根据ITS-1基因对其种类鉴定，这种方法以备广泛采用和实践，如辛玲等人采用该方法鉴定鸡球虫种类[5]。ITS-1基因在不同种球虫是存在差异性的，是作为种类鉴定的理想靶分子基因，不同物种ITS基因差异是较大的，这样可以较好地区别出不同种类球虫。本次扩增出ITS-1基因在同源性上，与已知柔嫩艾美耳球虫﹑火鸡球虫等差异性较大，同源性最高为96%（但只是扩增539bp中的部分序列），部分同源性更低，只有77%，初步说明本次白鹤球虫与已报道球虫ITS-1基因序列并不是同一序列，差异较大，可推测为它不同于其他球虫。在对作遗传进化树分析，发现其与所报道的Eimeria gruis在遗传距离上最为接近，而与其他球虫不在同一分支上，且离隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）遗传距离差距最大。

4.2 球虫病的发生与环境卫生﹑饲养密度﹑气候﹑饲养管理﹑鹤鸟日龄大小等因素呈密切相关的。所以球虫病防治必须搞好场地环境卫生， 搞好舍内卫生制度， 做好消毒措施， 并保持笼舍干燥清洁， 保持饮水和食物的干净清洁。营养条件是控制球虫病另外重要手段，应供给鹤群充足营养的饲料， 补充足够维生素A和C，发病时减少饲料中的钙含量等，对于球虫病控制也是十分必要的。一旦发生球虫病，除了药物，应给予鱼肝油配合治疗，提高疗效。