一株鸡源沙门氏菌的分离鉴定及药敏试验

熊菊萍，肖滢宇，王 稳，韩青松，高小龙，李增魁，文 英，仝丽娜*

（1.青海大学农牧学院 810000；2.温州科技职业学院 325006）

沙门氏菌（Salmonella）为革兰氏阴性兼厌氧杆菌，属于肠杆菌科沙门氏菌属，不形成芽孢﹑多数无荚膜﹑多单个存在[1]。该菌通常寄生在动物的肠道中，对大部分动物均有致病性，能引起多种动物的沙门氏菌病，症状以腹泻和败血症等为主。同时，沙门氏菌是人类细菌性食物中毒的主要病原之一，在人医﹑兽医和公共卫生上具有重要意义[2]。该菌血清型众多，目前已鉴定出2500多种[3]。常见的鸡沙门氏菌病有鸡白痢﹑鸡伤寒以及鸡副伤寒，分别由鸡白痢沙门氏菌﹑鸡伤寒沙门氏菌和其他具有运动性的沙门氏菌（主要为肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌）引起。沙门氏菌感染雏鸡后，可导致严重腹泻，死亡率较高，感染成鸡后，可引起腹膜炎﹑输卵管炎或造成隐性感染等[4,5]，造成生产性能和蛋品质降低，并且该菌可垂直传播，对养禽业危害巨大[6]。抗生素的应用，不仅有效降低和缓解了畜禽包括沙门氏菌病在内的多种细菌病毒防控的压力，也起到了促进动物生长的作用，然而随着养殖场抗生素类药物的广泛﹑持续﹑不合理﹑不规范使用甚至滥用，使沙门氏菌对抗生素类药物的耐药性越来越普遍，多重耐药菌株不断出现[7,8]。因此，调查了解沙门氏菌耐药性状况，对指导我省养鸡场合理用药具有重要意义。2020年10月，青海湟源县某散养鸡场部分雏鸡发病，病鸡精神沉郁﹑剧烈腹泻，后期死亡。为确定病鸡死亡原因，本研究无菌采集病死鸡脏器病料，分离到一株疑似菌，经革兰氏染色镜检﹑生化鉴定﹑16S rRNA基因扩增和测序后，鉴定为沙门氏菌，并对分离菌进行了致病性试验和药敏试验，旨在为本地区鸡沙门氏菌病的防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 病料

病料来自青海省湟源县某蛋鸡场病死鸡。

1.2 主要试剂

营养琼脂培养基﹑MH琼脂培养基购自杭州微生物试剂有限公司；SS琼脂﹑细菌微量生化鉴定管和抗菌药物药敏纸片购自青岛海博生物技术有限公司；革兰氏染色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；胶回收试剂盒和DL 2000 DNA Maker购自天根生化科技有限公司；2×EasyTaq PCR SuperMix购自北京全式金生物技术有限公司；营养肉汤购自北京奥博星生物技术有限公司；麦氏比浊管购自温州市康泰生物科技有限公司。

1.3 试验动物

1周龄SPF鸡购自宁波纯派农业科技有限公司。

1.4 分离培养与镜检

采用无菌操作，将采集的肝脏﹑脾脏样品进行沙门氏菌的分离纯化及鉴定。以平板划线法将样品接种于普通营养琼脂和SS琼脂培养基，于恒温培养箱内37℃培养约24 h。用接种环挑取平板上生长的菌落至SS琼脂培养基进行纯化培养。

用无菌接种环挑取1～2环生理盐水于载玻片中央，再用灭菌后的接种环挑取纯化培养后的沙门氏菌疑似菌落的单个菌落，与载玻片中央的生理盐水混匀，将混合物涂布至直径1cm左右的薄层，室温干燥后用酒精灯加热玻片固定菌。瑞氏染色法将制好的玻片染色，用电子显微镜观察菌体的形态特征。

1.5 生化鉴定

用无菌接种环或棉签将上述纯化培养后的菌落接种于色氨酸肉汤﹑赖氨酸脱羧酶﹑尿素酶﹑氰化钾﹑山梨醇﹑水杨苷﹑丙二酸盐﹑卫矛醇半固体﹑ONPG﹑甘露醇细菌生化鉴定管内，置于恒温培养箱内37℃培养18～24 h。参考《伯杰细菌鉴定手册》判定生化鉴定结果。

1.6 细菌16S rRNA基因扩增

水煮法提取分离纯化后的沙门菌DNA。设计16S rRNA 基因 引 物，16S rRNA-F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，16SrRNA-R: 5-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA3’，目的片段1500 bp。以提取的沙门氏菌DNA为模板，进行PCR扩增，反应体系为：2×Taq Mix 25μL﹑上下游引物各1μL﹑模板2μL，ddH2O将体系补至50μL。反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸10 min。将PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，目的片段切下后用胶回收试剂盒进行胶回收，将胶回收产物送至上海生工生物有限公司测序，测序结果在NCBI进行BLAST比对。

1.7 雏鸡致病性试验

将10只1周龄SPF雏鸡分为两组，每组各5只，第一组为试验组，第二组为对照组。第一组试验组的雏鸡腹腔注射1mL麦氏比浊度为1的分离菌菌液，第二组试验对照组腹腔注射1mL无菌的营养肉汤。每12h观察一次各组雏鸡的健康状况和死亡情况。将死亡的雏鸡进行尸体剖检，观察其内脏病变并采集脏器进行细菌的分离鉴定。

1.8 药敏试验

采用K-B纸片扩散法进行药敏试验。将纯化的细菌接种到SS培养基上，37℃培养24h，挑取单个菌落接种于5mL营养肉汤中，37℃﹑220 r/min摇床培养14h。用灭菌PBS调节菌液浓度至0.5麦氏比浊度。用灭菌棉签将稀释好的菌液均匀涂布于MH琼脂平板上，放置5min后贴上药敏纸片。将培养皿倒置放入恒温培养箱，37℃培养24～48h。测量抑菌圈直径。

2 结果

2.1 细菌的形态特征和镜检结果

从该鸡场病料中分离的细菌在SS琼脂培养基上呈现半透明﹑表面光滑﹑边缘整齐的圆形菌落（图1A）；革兰染色镜检为红色﹑长短不一的短杆菌，判断为革兰阴性菌（图1B）。

图1 分离菌株菌落形态和革兰氏染色镜检结果

2.2 生化试验

分离菌接种微量生化鉴定管后，生化鉴定结果如表1所示，赖氨酸脱羧酶﹑山梨醇﹑水杨苷和甘露醇试验呈阳性；色氨酸肉汤﹑尿素酶﹑氰化钾﹑丙二酸盐﹑卫矛醇半固体﹑ONPG试验反应呈阴性，与《伯杰细菌鉴定手册》中沙门氏菌的生化特征相符合。

表1 生化鉴定结果

2.3 细菌16S rRNA和invA基因扩增

以水煮法制备的分离菌DNA为模板，用16S rRNA引物进行PCR扩增，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，显示成功扩增出1500 bp的16S rRNA基因条带（图2）。切胶回收1500 bp的16S rRNA条带，胶回收产物送至上海生工生物有限公司测序，测序结果在GenBank公布的序列进行BLAST比对，结果显示与沙门氏菌同源性最高，为99.53%。由以上结果可判定该菌株为沙门氏菌。

图2 16S rRNA 基因 PCR 扩增结果

2.4 雏鸡致病性试验

试验组雏鸡在腹腔接种菌液后12h开始发病，36h后出现死亡，48h后全部死亡。将死亡雏鸡解剖后从脏器中成功分离出沙门氏菌；第二组对照组所有雏鸡均状况良好，无死亡状况。以上结果表明，该分离菌具有致病性。

2.5 药敏试验

根据药敏试验结果判定标准，药敏试验结果如表2所示，该菌株对阿莫西林﹑头孢唑啉﹑头孢噻肟﹑丁胺卡那﹑卡那霉素﹑四环素﹑多西环素﹑环丙沙星﹑氧氟沙星﹑蒽诺沙星﹑氯霉素﹑多粘菌素B﹑氟苯尼考敏感，对万氨苄西林﹑庆大霉素﹑链霉素﹑万古霉素和利福平有耐药性。

表2 药敏试验结果

3 讨论

鸡沙门菌病可通过多种途径进行传播，可水平传播，也可通过种蛋垂直传播，对养禽业危害较大[9]。为查明湟源县某蛋鸡场病鸡发病原因，本研究无菌采集病鸡脏器样品后，进行常规细菌分离培养。为达到快速﹑准确鉴定疑似菌目的，从脏器分离出疑似菌后，先进行了16S rRNA基因扩增和测序。测序结果与GenBank中公布的序列进行Blast比对分析后，发现分离菌与沙门氏菌同源性最高，为99.34%。随后，对分离菌进行了革兰氏染色，并接种沙门氏菌微量生化鉴定管，革兰氏染色镜检和生化鉴定结果进一步确认分离菌为沙门氏菌。后期将对分离的此株沙门氏菌进行进一步血清学分型鉴定。为确定该分离菌为致病菌，接种1周龄SPF小鸡进行攻毒试验，攻毒后小鸡均发病死亡，并且从病死鸡脏器中分离出该菌，表明此菌为该鸡场此次疫情的病原。抗生素作为控制细菌病感染的一种有效手段，在临床上得到了广泛应用。但由于抗生素的不合理使用，导致了越来越多的细菌产生了耐药性，多重耐药的沙门氏菌也不断从鸡场分离出来[10-12]，一定程度上增加了细菌病防控难度。为指导合理用药，本研究评价了该株沙门氏菌的耐药性，选择8大类18种药物进行药敏试验，结果显示该菌株对阿莫西林﹑头孢唑啉﹑头孢噻肟﹑丁胺卡那﹑卡那霉素﹑四环素﹑多西环素﹑环丙沙星﹑氧氟沙星﹑蒽诺沙星﹑氯霉素﹑多粘菌素B﹑氟苯尼考敏感，对万氨苄西林﹑庆大霉素﹑链霉素﹑万古霉素和利福平有耐药性，表明该菌株对头孢类﹑四环素类﹑喹诺酮类﹑氯霉素类药物敏感，而对青霉素类﹑氨基糖甙类和多肽类等多种药物产生了耐药性，且为多重耐药。与先前学者报道的一致，禽源沙门氏菌对常用抗菌药耐药情况较严重[10,11]。细菌耐药性的产生与细菌自身特性﹑耐药基因的传播和药物的使用情况等诸多因素有关[13]。因此，畜禽养殖场发生细菌性疾病时，准确快速鉴定致病菌，进行药物敏感试验，选择敏感药物进行治疗至关重要。同时，平时饲养管理中，规范临床抗生素使用，矫正抗生素的不规范使用，不同敏感抗生素之间交替使用，可有效减少多重耐药菌株的出现。