循环肿瘤细胞在肝细胞癌中的临床综合应用进展

欧伟森，刘高敏，徐继威

1.广东医科大学，广东 湛江 524023；2.梅州市人民医院 肝胆外一科，广东 梅州 514031

2020年世界卫生组织国际癌症研究机构（IARC）发布的数据显示，原发性肝癌是我国目前第4 位常见的恶性肿瘤以及第2位的肿瘤致死病因[1]，对我国百姓的身心健康造成十分严重的威胁。原发性肝癌以肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）发生率最高，占75%～85%，因其侵袭性和转移性很强，在疾病的初期就会侵犯到血管，从而导致远处转移。HCC目前主要依靠B超和AFP进行初步筛选，但二者缺乏足够的敏感度和特异度：B超等影像学检查的特异度＞90%，敏感度为65%～80%；当AFP的阈值为400 μg/L时，特异度为99%，敏感度为32%[2]。待到确诊HCC时，往往已发展至中晚期。因此迫切需要一种新型的肿瘤标志物来开启诊治HCC的新纪元。

作为液体活检的代表，循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）最先由Ashwort在1869年定义，即从恶性肿瘤原发部位脱落，通过血管或淋巴系统进入到血液循环的细胞[3]。CTC能否助力HCC的诊治，是当前探讨的热点问题[4]。

1 CTC对HCC早期诊断预测

AFP是当前早期诊断HCC的最常用指标，但缺乏足够的敏感性和特异性。而CTC在疾病临床表现前7～9 周即可被检测到[5]，因此其可能先于临床癌症诊断[6]，这对于早期诊断不明确、AFP阴性或影像学不典型的高危患者有着独特的优势[7]。Qi等[8]在2例HBV患者中检测到了低水平的CTC，并且在随访的5 个月内都出现了CT/MRI可检测到的微小HCC肿瘤。因此CTC的检测可能是极早期发现HCC的重要技术。目前最新的检测方法主要有：（1）基于EpCAM和ASGPR的双靶向功能化石墨烯薄膜，用于特异性识别HCC-CTC[9]；（2）基于GPC3免疫磁性材料荧光系统（C6/MMSN-GPC3）的新型CTC捕获平台，捕获效率比传统EpCAM免疫磁珠提高83.3%～350.0%[10]；（3）敏感度约85.7%的全自动集成微流控系统[11]；（4）敏感度和特异度分别为88.2%和100.0%的CTC计数联合GNB4/Riplet甲基化检测[12]；（5）利用抗ASGPR抗体和抗EpCAM抗体功能化的微流控协同芯片，敏感度和特异度分别为97.8%和100.0%[13]；（6）新型Ep-LMS/Vi-LMS-GPC3-LMS CTC检测系统，敏感度和特异度分别为98.1%和96.9%[14]；（7）在检测早期和AFP阴性HCC方面表现良好的ChimeraX-i120平台[15]；（8）ImagesteamX Mark Ⅱ流式细胞仪[16]。综上所述，随着检测技术的不断成熟，或许在不久的将来，CTC将有可能取代AFP的首选地位，更早期、更灵敏、更高效地用于HCC的早期筛查、诊断。

2 CTC对HCC肿瘤分期的参考

癌症的分期直接影响到治疗的选择和预后预测。目前国际上主流的HCC分期系统是巴塞罗那临床肝癌（BCLC）分期系统、TNM分期系统。而CTC则可以提供一种新型的参考指标。Yu等[17]发现，存活阳性CTC计数与TNM分期（P=0.002）和BCLC分期（P＜0.001）显著相关。有学者则发现HCC患者的CTC在BCLC A期和BCLC B/C期的阳性率分别为69.8%和87.5%[18]。更有研究进一步确认间充质CTC≥1 可作为判断BCLC分期的临界值[19]。早在2010年美国癌症联合委员会（AJCC）就已经在第7版《肿瘤分期指南》中将CTCs列入TNM分期系统；在第八版中，除保留cM0（i+）分期外，更进一步明确了CTC检测的临床价值。

3 CTC对HCC患者个体化治疗的指导价值

HCC具有明显的肿瘤异质性，这是影响患者预后的重要因素之一，也是为其制订相应个体化治疗的依据之一[7]。CTC是循环中潜伏的癌细胞，能够在治愈性切除后引起肿瘤复发，因此靶向消除CTC对于根治癌症显得十分重要。通过分析PD-L1+CTC与抗PD-1治疗反应之间的关联可知，接受PD-1检查点抑制剂纳武利尤单抗的5 例患者有治疗反应[20]。有学者更是开发出了多点共击纳米装置（GV-Lipo/SF/DT），可以特异性靶向治疗细胞并在捕获CTC后将其杀死，从而消除肿瘤的“根”和“籽”[21]。一项研究纳入了47例接受三联疗法[PD-1 抑制剂联合调强放疗（IMRT）和抗血管生成治疗]的HCC患者，发现基线时＜2个PD-L1 CTC的HCC患者接受三联疗法的客观缓解率（ORR）和总体生存率（OS）更好；并证实PD-L1 CTCs可以作为接受三联疗法的HCC患者的预测生物标志物[22]。FGL1是LAG-3的主要配体且通过二者结合来抑制肿瘤T细胞的功能，其可作为新发现的潜在免疫治疗靶点[23]。这类治疗靶点对于个体化治疗决策显得尤为重要，它可以帮助医师选择适当的药物治疗，以期改善反应结果。目前的研究已为HCC患者的靶向或免疫治疗提供了理论甚至是现实基础，但仍需要进一步的前瞻性研究加以验证。至于是否行肝切除术，Qi等[24]提出解剖性肝切除可能仅在低CTC计数和E/M-CTC阴性的患者中比非解剖性肝切除更有益，因此术前CTC分析可以更好地指导HCC患者切除方法的选择。与单纯肝切除术相比，接受PA-TACE治疗的M-CTC阳性患者的无复发生存期（RFS）和OS均有显著改善[25]。

4 CTC对HCC患者疗效的评价

HCC的治疗效果目前主要参考AFP及影像学检测；对于采用系统抗肿瘤治疗的HCC患者，大多采用RECIST 1.1进行疗效评价[26]。Li等[27]的研究出现了HCC患者接受索拉非尼治疗后CTC数量明显减少的迹象，从而认为CTC数量变化是接受索拉非尼治疗的HCC患者疾病无进展生存时间（PFS）的独立预测因子。血清AFP、甲胎蛋白异质体3（AFP-L3）及CTC三者联合可用于预测微波消融（MWA）后的疗效[28]。MWA治疗后CTC显著下降从而证实MWA对HCC患者有杀灭肿瘤细胞的作用；而在接受C-TACE治疗的患者中与MWA相比此作用没有显著差异[29]。但Wu等[30]却发现TACE治疗1、4周后CTC水平显著下降。通过对123例HCC患者的血液样本在肝切除前和肝切除后1个月进行检测，Sun等[31]首次报道了HCC患者肝切除后不久观察到CTC负荷显著降低，这很可能归因于原发肿瘤的手术切除；他们还认为，EpCAM+CTC可作为监测治疗反应的实时参考指标，准确而早期的决策有利于根据个体肿瘤的特征定制出最有效的治疗方案。HCC患者通过系统治疗后进行CTC检测，若其数量减少，说明治疗方式有效；在整个过程中实时动态监测CTC的数量变化，可协助医生了解治疗效果，及时治疗并调整方案。

5 CTC对HCC术前术后转移的分析

CTC是原发瘤和转移瘤之间的关键中间体，可以反映肿瘤侵袭性和转移潜力，并且可以成为肝内转移的预测标志物[11]。上皮-间充质转化（EMT）在肿瘤侵袭和播散中具有关键作用，且EMT先于肿瘤形成[32]，而转录因子Twist可能在HCC进展的早期阶段促进了EMT的发生[33]。截至2018 年第一项绘制CTC扩散途径并表征局部肿瘤患者CTC的综合研究中，科研人员发现不同血管部位的CTC在上皮和间充质组成上表现出空间异质性，这将有助于揭示HCC转移的新机制[34]。Li等[35]推测，门静脉肿瘤血栓可能是CTCs全身扩散的结果，是微转移形成的基础；并且推测CTCs中的Twist和Vimentin表达可能是评估转移的临床早期预测因子。有研究甚至表明CTC计数与血管浸润程度呈正相关，其预测HCC转移的敏感度和特异度分别为82.93%和52.38%[36]。而根治性手术后CTC计数≥3、负荷持续升高可能反映着肝外微转移的存在[37]。HCC早期即可发生肝内外转移，并且切除术后5年肿瘤复发转移率高达40%～70%，这可能与手术前存在的微小播散灶或多中心发生有关[26]。通过CTC对HCC患者的分析，我们可评估患者术前有无发生肿瘤转移，从而为其提供最优化的治疗手段。另一方面，相较于AFP，CTC在患者术后的复发转移方面更具有显著的预测价值。如果将这两者进行联合监测，将有利于提高HCC患者肝切除术后复发转移的预测效果[38]。

6 CTC对HCC患者预后的预测与评价

预后评估是患者经系统治疗后的关键步骤之一，其重点在于寻找预测指标，CTC是HCC患者预后指标的佼佼者。Meta分析则充分证明了HCC患者中CTC阳性者的OS要低于阴性者[39]。Liu等[40]在2013 年开发出基于高核质比的新型CTC检测方法，可用于高敏感性HCC患者的预后预测，特别是在短时间内评估患者是否会复发。通过随访数据分析，有学者认为其临界值在CTC计数≥3[37]、≥5[38]，此外还有各种CTC亚型，例如glypican-3阳性CTC[41]、Nanog CTCs[42]、CTC-WBC集群[43]等。并且，Twist+CTC[33]、M-CTC[44]或联合Ki-67[45]的预后评估要优于单独的CTC。CTC状态及超声组学评分[46]和术前CTC-NLR[47]则分别被视为HCC患者根治后早期复发（ER）和OS的预测因素。在肝移植方面，截至2021年诞生了第一项全面评估肝移植术后HCC患者围手术期CTC检测临床意义的研究，结果表明CTC计数是预测HCC患者肝移植后复发的一个有用的生物标志物，移植后连续监测CTC计数可能提供比单独使用传统监测方法更早的治疗干预机会[48]。同样，有研究发现术前EpCAM+CTC检测以及术前和术后第1天EpCAM+/CD90+CTC检测可预测活体肝移植（LD-LT）后HCC患者的复发，并可指导其术后监测和免疫抑制[49]。

7 小结与展望

传统的肿瘤确诊“金标准”仍旧是依靠细胞组织病理活检，但该方法存在着很多问题，如创伤性大、取材困难等缺点。相对而言，CTC具有无创、实时、方便、快捷、能够持续监测疾病的进程，以及对疗效检测、患者预后和复发情况进行判断和评估等优点，因此在未来对癌症的诊疗中或许大有作为。但由于现阶段检测技术有待提升，暂时也没有统一的检测标准，我们还需要多中心、大样本、足够时长的随访，不断积累足够的循证医学证据来支撑CTC在HCC临床诊疗中的实际应用。