钼酸盐功能化聚丙烯酰胺凝胶及其抗菌性能

＊韩耀 熊开容 龚鑫

（广东工业大学环境科学与工程学院 广东 510006）

病原微生物引起的疾病是一个日益严重的全球健康问题。例如，一些细菌、真菌、病毒等每年在世界各地造成数百万人死亡[1]。细菌感染是不可忽视的主要原因，虽然可以用抗生素治疗细菌和真菌感染，但抗生素的过度使用和使用不当导致多重耐药细菌的出现[2]。在当今使用的许多抗菌材料中，通过将杀菌剂掺入聚合物或水凝胶中，随后释放[3]。常用的杀菌剂有银纳米颗粒[4]、银盐[5]、金属氧化物[6]、卤素[7]或季铵化合物[8-9]等，但是这些都存在某些限制。例如，银基材料因其表现出优秀的体外杀菌性能而广受欢迎，但在实际条件下表现出低功效[4]；虽然季铵盐涂层通过破坏细菌的细胞质和外膜脂质双层起作用，然而，其抗菌性能可能会根据表面环境条件（例如，pH值、水的硬度和血液的存在）而降低[8]。因此，开发具有高效杀菌性的凝胶是一个突出的挑战。

聚丙烯酰胺（PAM）是水溶性线性高分子聚合物凝胶，具有亲水性好、溶胀度高、比表面积大、吸附效果好、柔韧性高以及良好的生物相容性等特性[10]。然而单组分的PAM凝胶功能单一，虽然应用广泛但有局限性，因而需要通过具有抗菌的无机材料对凝胶改性，增加其抗菌性能，同时也能提高其物理性能，例如抵抗外力延长使用寿命，实现凝胶的多功能化。多金属氧酸盐是一类金属氧簇，具有多种结构和优异的特性，已知和抗生素及有机生物活性化合物具有协同作用，与蛋白质氨基酸相互作用，导致影响细菌细胞活力的生物反应[11-14]。多氧钼酸盐被证明具有高抗菌活性[15]。

基于以上思路，本文制备出一种由PAM、钼酸铵、硝酸钙、环己烷组成的钼酸钙纳米簇凝胶（CMG），通过简单的混合搅拌即可获得。纳米线由Ca2+桥接Mo7O246-纳米团簇通过静电相互作用形成，采用PAM和钼酸钙纳米团簇（CMN）构建凝胶网络体系。以表面含氨基化学官能团的PAM作为主体，利用其表面的氨基在自组装过程中与纳米线原位反应形成共价键，环己烷通过配位和静电相互作用附着在纳米线，增加了凝胶的界面稳定性。所制备的钼酸钙纳米簇凝胶具有优异的孔隙率、保水性能等物理性质。所制备的凝胶具有优异的抗菌性能、高效及适应性广等优点。

1.实验

(1)实验原材料

硝酸钙（CN）：分析纯，广州化学试剂厂；钼酸铵四水合物（AM）：分析纯，上海麦克林生化有限公司；环己烷（CYH）：分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；无水乙醇（EA）：分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；聚丙烯酰胺（PAM）：分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；实验用水均为去离子水。

(2)CMG凝胶的制备

称取定量钼酸铵在40℃下溶解于去离子水中。冷却至室温后，将一定质量的硝酸钙加入反应溶液中并搅拌1h。随后，分别取一定体积的环己烷和一定质量的PAM相继加入混合溶液中。将混合溶液在60℃下搅拌24h。将产品用去离子水和无水乙醇离心洗涤多次，得到CMG。当钼酸铵的质量为0.2g、0.5g、1.0g时，得到的样品分别标记为CMG2、CMG5、CMG10。

(3)表征

通过扫描电子显微镜（德国蔡司公司Zeiss Gemini 300 SEM）观察了凝胶的形态和大小。在SEM测试之前，将凝胶样品冷冻干燥。

(4)凝胶含量

将凝胶称重，记作W0，在通风橱中干燥24h，然后在50℃下干燥48h直至达到恒定质量时，记作W1。

根据公式（1）计算凝胶含量G：

式中：W1是凝胶干重，g；W0为湿凝胶质量，g。

(5)水蒸气透过率

将凝胶称重，记作W0，在通风橱中干燥24h，然后在50℃下干燥48h直至当达到恒定质量时，记作W1。将凝胶（Ws）保存在湿度为40%，温度为37℃的保温箱中。在固定的时间间隔后，测量质量（Wt）。

根据公式（2）计算凝胶保水率S：

式中：W1是凝胶干重，g；Ws为湿凝胶质量，g；Wt为保存不同时间的凝胶质量，g。

(6)孔隙率

采用液体置换技术分析了水凝胶的孔隙率。从每种类型的凝胶中使用3个样品。将凝胶浸入乙醇中48h，直到它们被吸收饱和，然后重新称量凝胶。

根据公式（3）计算凝胶孔隙率P：

式中：W0是凝胶干重，g；Ww为湿凝胶质量，g；WL为乙醇中凝胶的质量，g。

(7)抗菌评估

采用圆盘扩散法[13]对样品进行体外抗菌实验。首先，将金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）和大肠杆菌（ATCC 25922）接种到营养肉汤培养基中。分别取100μL大肠杆菌和金黄色葡萄球菌（约106CFU/mL）均匀分布在琼脂平板上，将凝胶（直径6mm）置于琼脂平板上并在37℃下培养24h。测量并记录抑制区半径以评估抗菌活性。

(8)抗菌性能

根据平板计数法单位（CFU）对大肠杆菌（ATCC 25922）和金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）进行了实验。凝胶在紫外灯下提前灭菌2h。首先，原菌活化后，将金黄色葡萄球菌和大肠杆菌分别接种至营养肉汤液体培养基。随后将细菌稀释至105CFU/mL。将上述细菌悬浮液放入凝胶中后，在37℃下不断振荡2h。然后，从凝胶溶液中吸取100μL，将其稀释至合适浓度的细菌悬浮液均匀涂布到营养肉汤琼脂平板上，并在37℃恒温培养箱中培养24h。之后，记录细菌菌落并计数，实验重复3次。

根据公式（4）计算杀菌率I：

式中：N空白和N实验分别表示对照样品和实验样品的细菌数量。

2.结果与讨论

(1)CMG凝胶的微观结构

图1为凝胶表面的微观形貌图。虽然所制备的凝胶均表现出3D网格结构，但孔结构的微观特征因凝胶中的钼酸铵的量而异。CMG凝胶表现出不规则的开放交错网和层状结构。随着钼酸铵量的增加，孔壁加厚，孔壁变为相对规则和封闭，导致孔径减小。这可能是由于凝胶制备过程中氢键的增加，导致冰晶的生长受限，并导致冷冻过程中CMN和PAM分子之间的水吸附竞争。这种加厚的孔壁由许多蜂窝状的微孔组成，可以改善凝胶的孔隙率并增强毛细管作用。CMG复合凝胶的孔径较小，可防止内部水分蒸发。

图1 CMG的SEM图

(2)CMG凝胶的物理性质

①凝胶含量

为了定量评价交联度，对制备的水凝胶的凝胶含量进行了评价。从图2可以看出，CMG2、CMG5和CMG10凝胶的凝胶含量分别为23.8%、14.5%和9.1%。当钼酸铵数量增加至水凝胶结构重量的50%时，凝胶含量降低。

图2 CMG凝胶含量（a）和含水率（b）

②孔隙率

凝胶的多孔结构有助于从伤口表面吸收大量渗出物。它还有助于营养分配，并为细胞的粘附和生长创造良好的环境。图3为CMG凝胶的孔隙率图。在这里，钼酸铵的添加并没有大程度影响凝胶的孔隙率，在85%～91%范围内的孔隙率几乎相同。水凝胶的高度多孔结构将支持从伤口表面吸附伤口渗出物，以帮助伤口愈合。

图3 CMG的孔隙率

具有良好保湿性能的伤口敷料可以保持湿润的伤口愈合环境。如图4所示，钼酸铵对CMG的保水率有明显的影响。随着钼酸铵含量的进一步提高，CMG的保水率增加。37℃下1h后，CMG2、CMG5、CMG10的保水率分别为73.2%、80.9%、92.5%。CMG5具有优异的保水率和更小的孔径，可以防止内部水分蒸发。综上所述，CMG5具有良好的孔隙率和保水性，有助于吸收伤口渗出物并保持湿润的愈合环境。

图4 CMG的保水率

(3)CMG凝胶的抗菌活性

通过圆盘扩散法评估了CMG对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌活性，并统计了抑制区直径。图5为PAM、CMG2、CMG5、CMG10对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈照片。如图6所示，PAM的抑制区直径（IZD）等于0mm，没有抗菌活性。CMG2对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的IZD分别为9.52mm和6.01mm，显示出一定的抗菌活性，这归因于钼酸盐释放的钙离子破坏了细菌膜，破坏了DNA复制。与CMG2相比，CMG5的IZD均显著增加（p＜0.01），显示出更有效的抗菌性能，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的IZD分别为9.46mm和8.13mm。换句话说，在相同剂量的硝酸钙下，CMG5对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制程度是CMG10的1.3倍。说明过量的钼酸铵会促进凝胶团簇的形成，从而减弱了抗菌活性。

图5 PAM、CMG2、CMG5、CMG10凝胶对大肠杆菌（a）与金黄色葡萄球菌（b）的抑菌圈照片

图6 CMG2、CMG5、CMG10凝胶对大肠杆菌（a）与金黄色葡萄球菌（b）的抑菌圈效果图

(4)CMG凝胶的抗菌性能

图7为凝胶在不同时间大肠杆菌与金黄色葡萄球菌的活细菌数量。可见，CMG2和CMG5对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌表现出优良的抗菌性能，并具有抗菌持久性。如图8所示，空白PAM表面所黏附的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的数量分别为1.30×107CFU/mL、2.03×107CFU/mL，与空白PAM相比，CMG2表面黏附的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的数量分别下降到前者的1.54%和35.22%。CMG5表面黏附的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的数量分别下降到前者的0.77%和27.09%。大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在CMG10表面黏附的活细菌数量分别下降到空白PAM表面的44.62%和47.29%。结果表明，CMG凝胶具有一定的抗菌性能，且随着钼酸铵量的增加，CMG5对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌效果增强；但随着钼酸铵剂量的进一步升高，CMG10对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制呈下降趋势，抗菌效果越差（对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有影响）。抗菌功能的显著增强归因于钼酸盐和钙离子的协同功能。金属离子的释放是主要的灭菌途径，但过量的钼离子的存在导致离子释放减弱。总之，CMG5对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌表现出优异的抗菌活性。

图7 不同时间大肠杆菌（a）与金黄色葡萄球菌（b）的活细菌数量

图8 聚丙烯酰胺凝胶、CMG2、CMG5、CMG10凝胶在2h时对大肠杆菌（a）与金黄色葡萄球菌（b）的抑菌效果图

3.结论

钼酸盐和硝酸钙通过静电相互作用形成纳米线，并通过配位和静电相互作用与聚丙烯酰胺交联，制备了一种抗菌凝胶。通过SEM进行了表征，相比于CMG2、CMG10凝胶，CMG5凝胶具有良好的孔隙率和保水性等物理性能。圆盘扩散法实验表明所制备的CMG5凝胶对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制区直径（IZD）分别为9.46mm和8.13mm。平板菌落计数法抗菌实验表明所制备的抗菌凝胶对大肠杆菌的杀菌率达99.23%。综上所述，该钼酸钙纳米簇凝胶在抗菌、伤口敷料等领域具有巨大的应用潜力。