影响肌纤维发育的不同外源性物质研究进展

孔德庆，秦 箐，张崇妍，刘治辰，徐晓龙，兰茗熙，王一川，张景文，赵 丹，王志新，李金泉，刘志红

（1.内蒙古农业大学动物科学学院，内蒙古 呼和浩特 010018；2.内蒙古自治区动物遗传育种与繁殖重点实验室，内蒙古 呼和浩特 010018；3.农业农村部肉羊遗传育种重点实验室，内蒙古 呼和浩特 010018；4.内蒙古自治区山羊遗传育种工程技术研究中心，内蒙古 呼和浩特 010018）

畜牧业是我国的重要行业，畜牧业发展中提高畜禽产品产量及质量是重要环节。骨骼肌是畜禽机体主要组成部分，骨骼肌发育的研究利于在遗传育种中改良畜禽生长性状，进而在实际生产应用中提高肉产量等畜禽生产水平。肌纤维构成骨骼肌，骨骼肌发育的本质是肌纤维发育，研究肌纤维发育的目的是促进肌纤维发育，使肌纤维的体积或数量扩增［1］。畜禽肌纤维发育早已研究到基因层面，相关基因之间是存在协同或拮抗作用的。一些物质（如信号通路需要的酶）在畜禽机体内不存在或不足，需要通过外源性物质的添加来调控肌纤维发育相关基因，进而促进肌纤维发育。

外源性物质的添加方式主要有植入和饲喂等，可通过人工合成来提供原料，再植入或饲喂到畜禽体内。基因等微观物质可以采用植入方法进行添加，植入外源性物质主要通过注射或基因编辑等方式来进行。若能永久性改变基因，可选基因突变产生的优良种质进行育种，进而应用到畜禽生产中。该文以近5 年研究文献为材料，对影响肌纤维发育的不同外源性物质进行综述，为畜禽的育种及改善肉质提供思路。

1 肌纤维的发育机制

肌纤维也称肌细胞，它是骨骼肌主要组成部分。肌纤维按类别可分成Ⅰ型（耐酸而碱不稳定）肌纤维和Ⅱ型（耐碱而酸不稳定）肌纤维，肌纤维发育的不同时期中Ⅰ型肌纤维和Ⅱ型肌纤维比例和变化都不同［2］。肌纤维发育时期可分为胚胎发育期和出生后发育期，其中胚胎发育期主要是：生成肌祖细胞，形成肌细胞，肌管分化成肌纤维，以及肌纤维发育至成熟。而肌纤维的大部分发育在胚胎发育期就已经完成，其在出生后数量通常不变，所以出生后发育期研究重点是如何增加肌纤维的体积［3-6］。

2 与肌纤维发育调控相关的主要基因及信号通路

生 肌 调 节 因 子 （muscle regulatory factors，MRFs）是参与肌纤维发育调控的重要基因家族，其家族成员主要包括生肌决定因子（myogenic determining factor，MyoD）、肌细胞生成素（myogenin，MyoG）、生肌调节因子4 （muscle regulatory factor 4，MRF4）和生肌调节因子5 （myogenic factor 5，Myf5），在肌纤维发育过程中参与肌肉前体细胞增殖、肌纤维形成、出生后肌肉功能调节等［7］。配对盒基因（paired box gene，Pax）也是肌纤维发育调控中不可或缺的基因家族，其家族成员主要包括Pax3 与和Pax7，而Pax3 和Pax7 在肌发生中部分功能有相同之处，可共同调控肌纤维发育［8］。此外还有其他负调控肌纤维发育的基因，如肌生长抑制素（myostatin）基因MSTN 等，敲除MSTN 可促进肌纤维发育，对肌纤维发育的研究也十分重要。Wnt 信号通路和音猬因子（sonic hedgehog，Shh）信号通路是2 个功能相似的信号通路，两者起协同作用可共同激活Myf5［9-10］。

3 对肌纤维发育调控基因及信号通路有影响的外源性物质

3.1 对肌纤维发育基因及信号通路有影响的外源性物质种类

对肌纤维发育基因及信号通路有影响的外源性物质主要分成以下6 类：①与甲基化相关外源性物质：其影响的基因有MRFs 家族、Pax7 等。这类物质主要包括IGF-Ⅰ的DNA 甲基化状态、含甲基供体的营养素、Mll1 等。甲基结合在某些促生长因子特定部位，可与生肌因子相互作用促进肌纤维发育。②与有机酸相关外源性物质：其影响的基因有MRFs 家族、Pax3 与Pax7 等。这类物质主要包括氨基酸（Ile、Leu、Met 等）和其他有机酸（油酸等）。某些氨基酸可促进肌肉蛋白合成，其他某些有机酸可激活或促进信号通路转导。③与催化调节相关外源性物质：其影响的基因有MRFs 家族、Pax7 等。这类物质主要包括酶（PRMT1 等）、激素 （睾酮、ISO 等）；其影响的信号通路有Wnt 和Shh 信号通路等。这类物质主要包括酶（ENPP2、JARID2、ADAMTS5 等）、激素相关物质（TEST-E、TREN 等）。某些酶能促进肌原蛋白表达，某些激素相关物质能促进肌纤维发育相关基因表达。④与转录相关外源性物质：其影响的基因有MRFs家族、Pax3 与Pax7 等。这类物质主要包括转录因子（lncMGPF、EGR1、HEYL、KLF4、Ldb1、MRTF-A等），miRNA（miR-27b、miR206、miR-204、miR145、miR181 等）；其影响的信号通路有Wnt 和Shh 信号通路。这类物质主要包括转录因子（TGFβ 等）和其他蛋白（FNDC4、Plec、Podocan 等）。某些转录因子可辅助聚合RNA，其与某些miRNA 起协同作用共同调控肌原细胞，某些蛋白起转录后调控作用。⑤与基因相关外源性物质：其影响的信号通路有Wnt 和Shh 信号通路。这类物质主要包括MyD88、MFCS4 等。这类物质较少，但其相关研究比较重要，其本身就可能具有调控肌纤维发育作用的某些基因，其与其他正调控因子起协同作用，或与负调控因子起拮抗作用，以促进肌纤维发育。⑥其他外源性物质：其可能不属于主流研究或研究较少不便于分类的某些外源性物质。其影响的基因有MRFs 家族、Pax3 与Pax7 等。其主要包括FMN、硅酸盐、穿心莲内酯、小球藻、二甲双胍、维生素A、白细胞介素4 等；其影响的信号通路有Shh 信号通路等。其主要包括紫黄嘌呤等。其可能直接影响肌纤维发育相关基因或信号通路，也可能通过影响甲基化相关外源性物质、转录相关外源性物质来间接影响肌纤维发育相关基因或信号通路。

3.2 影响MRFs 家族的外源性物质

与甲基化相关外源性物质：MyoD 与类胰岛素一号生长因子（insulin-like growth factors-Ⅰ，IGF-Ⅰ）的DNA 甲基化状态相互作用于不同发育阶段来调控肌肉生长，因此可植入IGF-Ⅰ来促进MyoD 表达［11］。饲喂含甲基供体的营养素可使Ⅱ型肌纤维增多，可增加肌纤维横切面积，上调Myf5 等，以及促进线粒体合成相关基因的表达［12］。甜菜碱属于含甲基供体的营养素，饲喂甜菜碱可通过影响NFATc1 信号通路来增强成肌细胞分化，通过负调控MyoD 的表达来抑制成肌细胞增殖，整体上促进肌纤维发育［13］。植入混合谱系白血病蛋白-1 （mixed lineage leukemia-1，MLL1）可通过介导其启动子上的组蛋白第三亚基四号赖氨酸的三甲基化 （trimethylation of lysine 4 on histone H3 protein subunit，H3K4me3）进而调控Myf5，来促进Pax7 的表达以及成肌细胞的增殖［14］。

与有机酸相关外源性物质：饲喂异亮氨酸（isoleucine，Ile）可 上 调 肌 球 蛋 白 重 链（myosin heavy chain，MyHC）、MyoD、MyoG、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARg）以及脂肪酸合酶（fatty acid synthase，FAS）蛋白等物质的水平［15］。饲喂亮氨酸（leucine，Leu）可调控IGF mRNA、肌肉生长相关基因的表达，通过调节AKT/TOR 信号通路增加肌肉蛋白合成，并通过调节AKT/FOXO3a 信号通路减弱蛋白降解，从而促进肌纤维发育［16］。

与催化调节相关外源性物质：植入蛋白精氨酸甲基转移酶1（proteinargininemethyltransferase1，PRMT1）使MyoD 介导的肌原蛋白表达得到促进，使MyoD R121 位点的精氨酸甲基化对其DNA 结合活性和反转录活性得到增强［17］。饲喂睾酮可增加成纤维细胞生长因子2 （fibroblast growth factor 2，FGF2）的表达，而降低MRF4 和肌生成抑制素的表达［18］。脂素lipin1 的缺失抑制了蛋白激酶PKC 亚型活性，也抑制了Ⅱ类去乙酰化酶HDAC5功能，从而抑制肌细胞特异性增强因子2C（recombinant myocyte specific enhancer factor 2C，MEF2C）和MyoD 的表达，反之其植入对MEF2c和MyoD 有促进作用［19］。

与转录相关外源性物质：lncMGPF 作为长链非编码RNA，是miR-135a-5p 的分子海绵，其植入可使肌细胞增强因子2C（myocyte enhancer factor 2C，MEF2C）表达增加，也可使MyoD 和MyoG的信使RNA 稳定性增强，进而促进肌肉分化［20］。植入早期生长应答因子1（recombinant early growth response protein 1，EGR1）可以正向调控MyoG，进而调控肌纤维发育［21］。

其他外源性物质：植入芒柄花素（formononetin，FMN）可抑制肌肉生长抑制素的表达，可增加磷酸激酶的磷酸化，可增加肌原性增殖分化标志物数量，也可促进MyoD 和肌原蛋白的表达［22］。饲喂适量硅酸盐，其中的硅离子可促进MyoG、MyoD、神经生长因子（neurturin，NRTN）和γ-氨基丁酸（aminobutyric acid，GABA）的表达，进而促进肌纤维发育［23］。饲喂穿心莲内酯可促进MyoD、MyoG、成肌细胞融合蛋白Myomaker、肌原调节蛋白1（myozenin 1，Myoz1）和Myoz3 等与肌管分化相关基因表达，也可促进H3K4Me2、H3K4Me3 和H3K36Me2 等组蛋白修饰［24］。饲喂小球藻可促进miR-133b 和miR-206 的表达，即调节微小核糖核酸（microRNAs，myomiRs）的表达，也可促进成肌细胞的增殖分化［25］。

3.3 影响Pax3 与Pax7 的外源性物质

与甲基化相关的外源性物质：Pax7 在Mll1 成肌细胞中的重新表达可恢复H3K4me3 在Myf5 启动子上的富集并促进Myf5 的表达，所以植入Mll1可促进Pax7 在体内的表达并增强卫星细胞的功能［26］。

与有机酸相关外源性物质：饲喂蛋氨酸（methionine，Met）可使Myf5 调控的阳性卫星细胞密度有下降的趋势，而使Pax7 表达的细胞密度有增加的趋势，总体上还是起促进肌纤维发育的作用［27］。在没有激活剂噻唑烷二酮的情况下，油酸可使Pax3 和MyOD1 表达降低，但使Pax7 和MyoG 表达升高，总体上饲喂油酸可以促进肌肉发育［28］。

与催化调节相关外源性物质：注射异丙肾上腺素（ISOprenaline，ISO）可激活β-肾上腺素信号，诱导成肌细胞增殖，增加Pax7 调控的阳性成肌细胞百分比和骨骼肌纤维大小［29］。饲喂睾酮能够促进腿肌中雄激素受体（androgen receptor，AR）的表达，增加p-Akt 激酶的含量，上调Pax7 的表达，进而促进肌纤维的增殖［30］。

与转录相关外源性物质：植入转录因子HEYL 和Krupple 样因子4（Kruppel-like factor 4，KLF4）可促进从成纤维细胞衍生的Pax3 调控的阳性肌原性祖细胞表达［31］。LIM-结构域结合蛋白1（LIM domain binding protein 1，Ldb1）被独立于蛋白复合物Ctcf-Cohesin 招募到Pax3 结合元件上，这是H3K4me1 在这些位点和染色质环上有效沉积所必需的，即植入Ldb1 对Pax3 有一定促进作用［32］。植入转录因子心肌相关转录因子-A（myocardin related transcription factor A，MRTF-A）可通过与其远端CArG 盒序列结合，作为一种新的Pax7 调节因子参与Pax7 介导的成肌细胞增殖分化［33］。miR-27b 与Pax3 作用相反，miR-27b 直接靶向Pax3 mRNA 的3＇-非翻译区，植入miR-27b可负调控Pax3 因子的表达来抑制骨骼肌卫星细胞的增殖，但促进骨骼肌卫星细胞的分化，整体来说其对肌纤维发育也有促进作用［34］。Pax3＇非翻译区不同的Pax3 信使RNA 的亚型易受miR206 的调控，植入miR206 可导致体内Pax3 因子的水平不同［35］。Pax7、IGF-Ⅰ和MEF2C 分别是miR-204在成肌细胞增殖分化过程中的靶基因，植入miR-204 可促进Pax7 表达［36］。miR145 可以上调Pax3、Pax7、MyoD1、MyoG 和MyHC2，而miR181 可以触发Myf5 和MyHC2 等肌原性因子表达，所以可植入这两种miRNA 以促进肌肉发育［37］。

其他外源性物质：饲喂二甲双胍可使Pax7 因子水平及其阳性细胞数量显著增加，也可使卫星细胞增殖［38］。饲喂VA 可促进Pax7 阳性卫星细胞和 肌 原 性 标 记 基 因 包 括Pax7、Myf5、MyoD 和MyoG 的表达。VA 也增加了氧化型Ⅰ型和ⅡA 型纤维的比例，降低了乙醇型IIX 型纤维，其整体上起促进肌纤维发育作用［39］。植入白细胞介素4 可促进胚胎干细胞分化过程中早期肌原基因如Mesogenin1、Pax3 和Pax7 的表达［40］。

3.4 影响Wnt 和Shh 信号通路的外源性物质

与催化调节相关外源性物质：外核苷磷酸二酯酶Ⅱ型 （recombinant ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 2，ENPP2）受WNT/ β-Catenin 信号调节因子的调控，其植入可促进肌纤维肌源性分化［41］。植入组蛋白去甲基化酶（jumonji，AT rich interactive domain 2，JARID2）和多梳抑制复合物2 （polycomb repression complex 2，PRC2）复合物可通过抑制Wnt 拮抗剂而促进Wnt信号通路来调节肌肉分化［42］。血小板反应蛋白解整合素金属肽酶5 （recombinant A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin 5，ADAMTS5）和Shh 协同调控MyoD 的表达，作用并不依赖于ADAMTS5 的催化活性，即植入ADAMTS5 可调节影响肌肉发育的重要细胞信号通路中的非酶功能［43］。饲喂庚酸睾酮（testosterone enanthate，TEST-E）和群勃龙（trenbolone，TREN）可增加雄激素敏感的提肛肌/球海绵体肌中的Wnt5a 蛋白，即芳香化和非芳香化雄激素增加了骨骼肌中Wnt5a 蛋白的表达［44］。

与转录相关外源性物质：植入转化生长因子β 活化激酶（TGF-β activated kinase，TAK1）可使Shh 和转录因子Gli2 的转录本显著上调［45］。植入含纤维连接蛋白Ⅲ型结构域4 （fibronectin typeⅢdomain-containing protein 4 ，FNDC4）可以通过转录后调控作用激活Wnt/β-连环蛋白信号转导，进而影响成肌细胞C2C12 的分化［46］。血小板及白细胞C 激酶底物（platelet and leukocyte C kinase substrate，Plec）和肌成纤维细胞（myofibroblast，MyoF）的转录后调控作用可以保护蓬乱蛋白Dsh 同源物2（dishevelled，dsh homolog 2，Dvl-2）免受自噬介导的降解来保持稳定状态，即植入Plec 可通过激活Wnt/β-连环蛋白信号通路促进骨骼肌发育［47-48］。Podocan 蛋白是正常C2C12 分化所必需的，其植入可通过转录后调控作用增强Wnt/β-连环蛋白通路进而促进肌生成［49］。

与基因相关外源性物质：植入髓样分化因子（myeloid differentiation factor 88，MyD88）可在肌生成过程中调节非典型的NF-κB 信号通路和典型的Wnt 信号通路，促进小鼠骨骼肌生长，以及促进过负荷诱导的肌纤维肥大［50］。缺乏Shh 顺式增强子（ShhMFCS4/—，MFCS4）的小鼠，会减少舌背上皮Shh，扰乱舌隔肌腱的形成，破坏了内在肌肉模式，反之说明植入MFCS4 可促进肌肉生成［51］。

其他外源性物质：饲喂紫黄嘌呤可激活Shh信号，或促进吗啉基（morpholino，MO）表达进而激活转录抑制因子Gli3 的敲除，挽救了miR-133 敲除（knock-down，KD）表型，参与构建Shh/MRF/miR-133/Gli3 轴［52］。

3.5 影响其他肌纤维发育调控相关基因及信号通路的外源性物质

与有机酸相关外源性物质：饲喂丁酸能增加PPAR γ 共激活因子1α （PPAR-γ coactivator 1 alpha，PGC-1α）水平，增加靶TEA 结构域转录因子1（TEA domain transcription factor 1，TEAD1）基因水平，以及增加miR-208b 和miR-499-5p 水平，以达到促进肌纤维发育的目的［53］。饲喂N-氨甲酰谷氨酸（N-carbamylglutamate，NCG）可转化相关基因（MSTN、PPAR-γ 和PGC-1α）表达，增加Ⅰ型肌纤维比例，提高肌肉抗氧化机能，从而改善肌肉品质［54］。饲喂丁酸、辛酸和棕榈酸可能通过促进AMPK 信号通路和Ca2+依赖的信号通路来增加肌纤维密度以及较小直径肌纤维比例［55］。饲喂较低水平二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）可通过激活AMPK／Sirtl 信号通路途径促进白肌增生和肌纤维发育，但高水平的DHA 可通过激活P53/Cycling 信号通路途径诱导细胞周期停滞而抑制生长，所以需要控制用量［56］。

与转录相关外源性物质：植入miR-499-5p可能通过下调转录因子猪Sox6 （porcine Sox6，pSox6）的表达来促进氧化肌纤维的形成［57］。miR-152 直接靶向解偶联蛋白3 （uncoupling protein 3，UCP3）的30 个非翻译区 （unique taxpayer reference，3＇-UTR），导致其在蛋白水平上转录后抑制，而UCP3 相关信号通路介导了miR-152 在慢收缩肌纤维形成中的作用。即植入miR-152 可促进慢收缩肌纤维形成和骨骼肌生成来调控肉质［58］。Vgll3 蛋白过表达可降低Hippo 信号通路负反馈回路的活性，可影响肌肉调节基因Myf5、Pitx2 和Pitx3 等基因的表达，以及可编码某些Wnts 和IGFBP 蛋白相关基因的表达。即植入Vgll3 可作为一种转录基因辅助因子与Hippo 信号通路一起控制肌生成［59］。

与基因相关外源性物质：FSIII 基因使Smad和Erk 通路被抑制，使PI3k/Akt 通路激活。MyoD、Myf5 和MyoG 转录水平上调，而MRF4 转录水平下调。即植入FSIII 基因可通过调控与MSTN 相关的信号通路，以及调控肌原性调节因子的表达，进而整体上介导骨骼肌肥大［60］。

其他外源性物质：饲喂原花青素B2（proanthocyanidin B2，PB2）可通过调控AMPK 信号通路来促进C2C12 肌管中慢收缩肌相关基因的表达［61］。植入MST1/2 激酶的抑制剂XMU-MP-1 可刺激YAP 相关信号通路在成肌细胞和肌管中的核定位，可上调肌原蛋白，进而促进成肌细胞融合［62］。酶解大豆蛋白效应物Ala-Phe 二肽可通过激活ERK1 和ERK2 信号通路来促进成肌细胞增殖和分化，Glu-Tyr 二肽可通过激活ERK1 信号通路促进成肌细胞增殖和分化，而Glu-Tyr 和Ala-Phe 二肽都能通过激活TOR 信号通路促进成肌细胞蛋白质合成。所以可通过饲喂酶解大豆蛋白来促进肌纤维发育［63］。饲喂萝卜硫素（sulforaphane，SFN）可激活Akt 蛋白，可通过Foxo 蛋白依赖的信号通路增强蛋白质合成，进而增加肌管直径［64］。

4 利用敲除等手段调控其他基因

由于存在一些负调控肌纤维发育的因子，需要使用敲除或消融手段消除这类因子，以达到促进肌纤维发育的目的。这类因子包括基因（MSTN、Sox6 等）、蛋白（Hes1、TMEM182 等）。在胎儿时期敲除功能性MSTN 可通过促进肌纤维的增生和肥大导致肌肉质量的显著增加［65］。Sox6 是体内慢肌相关基因表达的肌纤维富集抑制因子，敲除Sox6可使慢肌的纤维数量增加［66］。在干细胞中消融转录调节因子Hes1 振荡器可干扰稳定的MyoD 振荡，也可导致MyoD 持续表达时间延长，进而导致分化倾向的增加［67］。跨膜蛋白182（transmembrane protein 182，TMEM 182）可在功能上抑制成肌细胞的分化和融合，其与整合素β 1 （integrin beta 1，ITGB1）可相互作用。TMEM182 的肌原性缺失可提高ITGB1 与层粘连蛋白的结合活性，在肌发生过程中可诱导FAK-ERK 和FAK-Akt 信号轴的激活。所以敲除TMEM182 可促进肌纤维发育［68］。

5 展望

综上所述，肌纤维生长发育相关基因相互影响，而基因也受到外源性物质的调控。虽然已经探索发现了许多外源性物质对基因的影响，但还有很多方面问题亟待解决。比如MSTN 突变体与MSTN 作用相反，是否其他负调控因子突变也有类似情况？ 比如不同外源性物质若同时添加到畜禽体内，是否起协同作用而更好地促进肌纤维发育，具体还需要加以验证。今后，还需加强肌纤维基因的研究，找到更多对肌纤维发育影响的基因以及相关外源性物质，并将其应用到畜禽育种和生产中。