柴胡三参胶囊对心肌缺血再灌注损伤大鼠心脏的保护作用及铁死亡机制研究

何 涛，刘建和，杨耀闾，张杼惠，曹 蛟，冯 君*

1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；2.国家中医心血管病临床医学研究中心分中心，湖南 长沙 410007

心血管疾病是威胁人类健康最主要的原因之一。 《中国心血管健康与疾病报告2019》指出：至2017 年底，我国农村地区冠心病病死率达76.04/10万人，严重危害居民健康[1]。 目前，再灌注策略是急性心肌梗死的首选治疗措施，溶栓、经皮冠状动脉介入等治疗手段能够快速恢复缺血心肌的血液供应，以挽救濒死的心肌，减少心肌梗死面积，保持左心室的收缩功能，降低死亡率[2]。 然而，再灌注可能会导致额外的心脏损伤，即心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia reperfusion injury, MIRI）[3-4]。因此，如何减轻MIRI 成为心血管治疗急需解决的问题之一。

有研究表明，铁死亡在MIRI 病理过程中普遍存在，抑制铁死亡在心肌稳态和心血管疾病中起到重要保护作用[5-6]。 盐酸地尔硫艹卓片能够减轻氧化应激损伤，纠正能量代谢，增加MIRI 后对心脏的保护作用[7-8]，故本研究选择其作为阳性对照药物。 课题组前期研究发现，柴胡三参胶囊通过升高超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）水平，降低血清血清乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）、肌酸激酶（creatine kinase, CK）及丙二醛（malondialdehyde, MDA）水平，从而减轻大鼠MIRI[9]。 前期研究还表明，柴胡三参胶囊可通过抑制心肌细胞凋亡和炎症损伤，从而保护受损心肌[10]，但柴胡三参胶囊是否通过抑制铁死亡对MIRI 产生保护作用尚不清楚。因此，本实验通过构建大鼠MIRI 模型，探讨柴胡三参胶囊对MIRI 保护作用的相关分子机制，以期为柴胡三参胶囊在MIRI 中的应用提供新的策略。

1 材料

1.1 动物

健康雄性SD 大鼠84 只，SPF 级，体质量（220±20） g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SYXK（湘）2019-0009。 动物饲养于湖南中医药大学动物实验中心，饲养温度为（23±2） ℃，相对湿度59%，昼夜光照交替12 h。 本实验经湖南中医药大学实验动物伦理委员会批准， 批准号：SCXK（湘）2019-0004。

1.2 实验药品及制备方法

柴胡三参胶囊购自湖南中医药大学第一附属医院制剂室（批号：20200630）。 由柴胡、黄连、法半夏、丹参、苦参、党参、青蒿、甘草组成，药物剂量比例为15∶6∶10∶10∶10∶15∶10∶6，用生理盐水将胶囊内容物溶解成灌胃液[11]。 盐酸地尔硫艹卓片（规格：30 mg/片，天津田边制药有限公司，批准文号：国药准字H12020126）。

1.3 主要试剂

氯化三苯基四氮唑（2，3，5-Triphenyl-2H-tetrazolium chloride, TTC）（批号：T8877-10G，美国Sigma公司）；6-0 手术缝合针（批号：20111，宁波市成和显微器械厂）；BCA 蛋白定量试剂盒（批号：BL521A，北京兰杰柯科技有限公司）；PVDF 膜（批号：IPV00010，美国Millipore 公司）；ECL 显色液（批号：GE2301，北京鼎国昌盛生物技术有限公司）；高效RIPA 组织快速裂解液（批号：SL1020，北京酷来搏科技有限公司）；蛋白酶抑制剂混合液（批号：GRF101，上海雅酶生物科技有限公司）；兔抗混合谱系激酶3（mixed lineage kinase 3, MLK3）单克隆抗体（批号11996-1-AP，武汉三鹰生物技术有限公司）；兔抗c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase, JNK）多克隆抗体（批号：CY5490）、兔抗p38多克隆抗体（批号：CY5488）、兔抗p53 单克隆抗体（批号：CY2167）、兔抗NLRP3 多克隆抗体（批号：CY5651）、兔抗β-actin多克隆抗体（批号：AB0035）、山羊抗兔Ig G（H＋L）HRP（批号：AB0101）均购自上海Abways 公司；PBS缓冲液（批号：WH0321E111，武汉普诺赛生命科技有限公司）；脱脂奶粉（批号：A800889-0250，上海生工生物工程有限公司）。

1.4 主要仪器

RWD407 小型动物呼吸机（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；ECG-2303B 数字心电图机（广州市三锐电子科技有限公司）；JEB2002 电子天平（上海浦春计量仪器有限公司）；Cytation3 多功能酶标仪（美国BioTek 公司）；DYY-6C 电泳仪、DYCZ-40D 转膜仪（美国Bio-Rad 公司）；Chemi Doc XRS 化学发光凝胶成像分析系统（美国Bio-Rad 公司）；A1＋激光共聚焦显微镜（日本Nikon 公司）；HM325 石蜡切片机（上海徕卡仪器有限公司）；KD-BM Ⅱ电脑生物组织包埋机（浙江省金华市科迪仪器设备有限公司）；160HR 高速冷冻离心机（美国Thermo Fisher Scientific 公司）。

2 方法

2.1 分组及给药方法

将大鼠随机分为6 组，分别为假手术组、模型组、地尔硫艹卓组和柴胡三参胶囊高、中、低剂量组，每组14 只。灌胃剂量根据人与动物体表面积换算，70 kg成人临床剂量等效300 g 大鼠灌胃剂量，低剂量、高剂量分别为1/2、2 倍中剂量。柴胡三参胶囊每粒400 mg，中剂量为每次4 粒，每日3 次，总计4800 mg，换算成大鼠等效剂量为432 mg/kg。 故柴胡三参胶囊高、中、低剂量组分别给予柴胡三参胶囊溶液864、432、216 mg/（kg·d）灌胃，地尔硫艹卓组给予地尔硫艹卓溶液51 mg/（kg·d）灌胃。适应性喂养1 周后对大鼠进行灌胃，每日灌胃1 次，连续7 d，假手术组及模型组给予等溶积的生理盐水灌胃。

2.2 MIRI 模型的制备

除假手术组外，其余各组参照本团队前期基础进行手术[12-13]。 造模前12 h 禁食，自由饮水，末次灌胃30 min 后，腹腔注射戊巴比妥钠（10 mg/kg）麻醉大鼠。 取仰卧位，将四肢固定于手术台上，心电图机全程记录大鼠Ⅱ导联心电图，颈部、胸前区去毛，剪开颈部皮肤，逐层钝性分离颈部肌肉，直至暴露气管。用无菌刀片小心横向切开气管，并连接小型动物呼吸机，随后从胸骨左缘0.5～1 cm 处纵行剪开皮肤，逐层钝性分离两侧肌肉，直至暴露胸骨。 沿胸骨左侧第3～4 肋间打开胸腔，暴露心脏，剥离心包膜，运用6-0 缝合线小心结扎冠状动脉左前降支，以Ⅱ导联ST 段明显抬高或T 波高耸，结扎线以下心脏表面颜色变暗为造模成功的标志。结扎30 min 后松开缝合线，再灌注90 min。 再灌注结束后立即取材。假手术组大鼠只穿线，不结扎，同样全程记录Ⅱ导联心电图。有以下情况之一的大鼠退出实验：结扎前心电图异常者；结扎冠状动脉失败或未发现再灌注者；心脏破裂致大鼠死亡者。

2.3 大鼠心电图监测及心律失常评分

使用RM-6280 生物信号采集系统，麻醉固定后在大鼠四肢连接电极，分别记录造模前以及造模全过程心电图，记录每组大鼠恶性心律失常发生情况，根据Curtis-Walker 心律失常评分标准进行评分[14]：发生室性前期收缩＜50 次计0 分；发生室性前期收缩＜500 次计1 分；发生室性前期收缩＞500 次和（或）发作一过性室性心动过速或室颤计2 分；室性心动过速或室颤持续时间＜1 min 计3 分；室性心动过速或室颤持续时间≥1 min 且＜2 min 计4 分；室性心动过速或室颤持续时间≥2 min 计5 分；梗死15 min 之后发生致命性室颤计6 分；梗死4～15 min之内发生致命性室颤计7 分；梗死1～3 min 之内发生致命性室颤计8 分；梗死1 min 之内发生致命性室颤计9 分。 最后进行统计学分析。

2.4 TTC 测定心肌梗死面积

取出大鼠心脏后，用PBS 缓冲液由内至外清洗2 遍，用15 mL 离心管装好置于-20 ℃冰箱冷冻30 min，取出后置于冰上，沿垂直于心尖与心底连线方向进行切片，切弃心尖，余下组织共切5～6 片，每片约2 mm，置于1% TTC 磷酸缓冲液中，避光，并放入37 ℃水浴箱中孵育20 min，取出切片，置于l0%甲醛溶液中固定过夜，24 h 后利用高清单反相机拍照。 运用Image Pro Plus 软件计算梗死面积、心脏切片总面积。

心肌梗死面积百分率=组织切片梗死面积/总面积×100%

2.5 HE 染色观察各组大鼠心脏病理学变化

于再灌注结束后，用预冷的PBS 冲洗2 遍，取全心，用4%多聚甲醛溶液30 mL 固定于50 mL 的EP 管中，经梯度脱水、二甲苯透明、石蜡包埋处理，后置于切片机上切片，脱蜡，切片常规梯度乙醇脱水，行苏木精、伊红染色，二甲苯透明，中性树胶进行封片，最后于显微镜下观察各组大鼠心肌组织的病理学变化。

2.6 Western blot 法检测心肌组织铁死亡相关蛋白表达

每组取约100 mg 缺血区心肌组织装入经过高温高压蒸汽灭菌之后的1.5 mL EP 管中，剪碎心肌组织，加2～3 颗小钢珠，并加入适量RIPA 裂解液及总体积1%的蛋白酶抑制剂，置于预冷的匀浆机中匀浆，直至组织被匀浆成碎片，于4 ℃、12 000 r/min、半径17.8 cm 的低温超速离心机中离心10 min。 取上清液，随后用BCA 蛋白定量法测定各组蛋白浓度， 根据标准曲线公式制备相同浓度的上样缓冲体系，100 ℃加热20 min 使蛋白失活。 制胶，上样，电泳，先于80 V 恒压电泳30 min，待样本跑出浓缩胶后，改100 V 恒压90 min，200 mA 恒流转膜90 min，将含有蛋白的凝胶小心转移至PVDF 膜上，5%脱脂牛奶封闭1 h，并于摇床上均一化。TBST 洗脱3 次，每次1 min，参照biomarker 条带位置，在相应蛋白质分子量范围内分别孵育MLK3（1∶1000）、JNK（1∶2000）、p53（1∶2000）、及β-actin（1∶20 000）抗体，4 ℃孵育过夜，次日于冰箱中取出目的条带，用TBST 洗涤3 次，每次10 min，于室温下孵育山羊抗兔IgG（H＋L）HRP（1∶30 000 配置）1 h，TBST 清洗3 次，每次10 min，以洗去多余的二抗。 ECL 显色液进行目的条带显影，显影后保存图像，用Image J 软件分析各条带的灰度值并进行统计分析。

2.7 统计学分析

数据采用SPSS 21.0 统计学软件进行分析。 计量资料符合正态分布以“±s”表示，若各组数据均符合正态分布，则进行单因素方差分析，不满足正态性、方差齐性的多组比较采用Tamhane's T2 检验，两组之间比较用独立样本t 检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组大鼠死亡情况统计

在大鼠喂养期间无死亡，因麻醉意外、多次结扎致心脏破裂等死亡不纳入心电图统计分析及数据统计，但因恶性心律失常而死亡的大鼠纳入心电图统计分析，不进入最后的数据统计。 在实验过程中，假手术组大鼠无死亡；模型组大鼠因室颤死亡2 只；地尔硫艹卓组大鼠因手术意外死亡2 只；柴胡三参胶囊高剂量组因手术意外死亡2 只；柴胡三参胶囊中剂量组死亡2 只，其中因室颤死亡1 只，因多次结扎心脏破裂死亡1 只；柴胡三参胶囊低剂量组死亡4 只，其中因室颤死亡2 只，因手术意外死亡2 只。

3.2 各组大鼠心电图监测及心律失常评分

与假手术组相比，模型组大鼠心律失常评分显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，柴胡三参胶囊高、中剂量组及地尔硫艹卓组心律失常评分降低（P＜0.05），柴胡三参胶囊低剂量组心律失常评分差异无统计学意义（P＞0.05）。 详见表1。

表1 各组大鼠心律失常评分（±s，分）

表1 各组大鼠心律失常评分（±s，分）

注：CHSS.柴胡三参胶囊。与假手术组相比，*P＜0.05；与模型组相比，#P＜0.05。

组别假手术组模型组CHSS 高剂量组CHSS 中剂量组CHSS 低剂量组地尔硫艹卓组n 15 15 13 14 13 13评分0.13±0.35 3.00±0.65*1.69±0.48*#1.14±0.66*#2.46±0.52*0.46±0.52#

3.3 大鼠心肌梗死面积测定

TTC 与活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶反应而呈红色，而缺血组织内脱氢酶数量减少，活性下降，而呈白色，以此区分梗死区域与非梗死区域。TTC 染色结果显示，假手术组心肌组织无明显梗死，与假手术组比较，模型组心肌组织梗死区域显著增加（P＜0.05）；与模型组相比，柴胡三参胶囊低剂量组大鼠心肌梗死面积无明显变化（P＞0.05），柴胡三参胶囊中、高剂量组及地尔硫艹卓组大鼠心肌梗死面积均减少（P＜0.05）。 详见图1。

图1 各组大鼠心脏TTC 染色及心肌梗死面积测定结果

3.4 心肌组织病理改变

假手术组大鼠心肌细胞排列整齐，细胞核整齐均一，肌纤维走向有序，染色正常。 模型组大鼠梗死区域心肌细胞排列紊乱，细胞核大小参差不齐，大量细胞肥大、水肿、变性，但无明显细胞坏死；梗死远端区心肌组织无明显损伤，细胞形态、大小、走行方向与假手术组基本一致。 与模型组相比，柴胡三参胶囊低剂量组梗死区域心肌组织损伤程度无明显改善；柴胡三参胶囊中、高剂量组缺血区心肌组织有较明显改善，细胞排列较紊乱，部分细胞水肿变性，且高剂量组较中剂量组损伤减小；地尔硫艹卓组缺血区心肌组织明显改善，仅有少量细胞水肿，细胞排列相对整齐。 详见图2。

图2 各组MIRI 大鼠心肌组织病理变化（HE，×400）

3.5 心肌组织中铁死亡相关蛋白的表达情况

与假手术组相比，模型组大鼠缺血区心肌组织MLK3、JNK、p53 蛋白表达明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，柴胡三参胶囊中、高剂量组和地尔硫艹卓组MLK3、JNK、p53 蛋白表达显著降低（P＜0.01），柴胡三参胶囊低剂量组MLK3、JNK、p53 蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）。 详见图3。

图3 各组大鼠心肌组织蛋白表达情况

4 讨论

MIRI 为现代医学命名，中医典籍对其无相关论述，然根据其临床表现，多归属于“胸痹”“心痛”等范畴。柴胡三参胶囊由柴胡、法半夏、党参、丹参、苦参、黄连、青蒿、甘草组成，针对气滞血瘀痰阻之病机而设。方中柴胡为君，疏泄肝气、调畅气机；臣以苦寒之黄连清泄少阳，与柴胡相伍，取疏泄和解之意；法半夏下气化痰，丹参活血清心，亦为臣药；佐以青蒿辛开苦泄，化痰定悸，苦参燥湿清火，共助柴胡和解少阳之功；党参健脾益气，有助血液运行，甘草缓急，调和诸药，共为佐使。 全方合用具有疏肝行气、化痰活血、和解伏邪之用。

MLK3 是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶， 被认为参与包括癌症、肺纤维化和缺血性脑损伤在内的多种疾病[15-17]。 同时，MLK3也被认为在心肌细胞损伤的保护中发挥重要作用，研究发现，MLK3 的下调可以保护H9c2 细胞免受缺氧引起的凋亡和缺血再灌注损伤[18]。上调miR-138，可以通过负向调控MLK3保护H9c2 细胞免受缺氧诱导引发的细胞死亡[19]。JNK 是MLK3 信号传导的一种重要下游介质，可以激活p53 的表达，抑制System Xc-的活性，致使GPX4的底物谷胱甘肽（glutathione, GSH）合成受阻，从而诱导ROS 的蓄积，导致铁死亡的发生[20-21]。 因此，降低MLK3 的表达，可通过抑制MLK3、JNK、p53 通路减少缺血再灌注所致的铁死亡。

本研究构建MIRI 大鼠模型，结果发现心肌缺血30 min 再灌注90 min 后大鼠左心室发生较明显梗死，心肌细胞排列紊乱，细胞间隙水肿，心脏功能发生紊乱，铁死亡相关蛋白MLK3、JNK、p53 表达明显上升；给予柴胡三参胶囊中、高剂量预处理的大鼠心脏功能较前显著改善，心律失常的发生率降低，心肌细胞排列整齐，细胞之间无水肿，且心肌梗死面积减少，MLK3、JNK、p53 的表达下降，表明柴胡三参胶囊中、高剂量预处理可以减少缺血再灌注大鼠铁死亡的发生。

综上所述，柴胡三参胶囊中、高剂量预给药能够有效改善MIRI 大鼠模型心肌梗死病理状况，减轻心肌梗死再灌注大鼠铁死亡进程，其机制可能与抑制大鼠MLK3、JNK、p53 蛋白表达有关。