人参皂苷通过上调糖皮质激素受体表达对AIH 小鼠肝脏的保护作用

曹梦醒，师 哲，李 勇*

上海中医药大学附属市中医医院，上海 200071

自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis, AIH）是一种自身免疫反应介导的进行性肝脏炎症，其诊断以谷丙转氨酶（alanine aminotransferase, ALT）、谷草转氨酶（aspartate aminotransferase, AST）、免疫球蛋白IgG 以及自身抗体（ANA、SMA、抗LKM1 和抗SLA）水平升高为主[1]。 AIH 常隐匿起病而无特异性症状，常表现为嗜睡、乏力、右上腹疼痛等，且近30%患者首诊时已存在肝硬化表现[2]。 虽然AIH 的发病机制尚不明确，但与药物接触、病毒性肝炎史以及遗传易感个体等因素高度相关[3]，是一种T 细胞产生针对肝脏自身抗原的免疫反应[4]。 临床一线用药以大剂量地塞米松和（或）联合硫唑嘌呤抑制T细胞免疫力为主，但这种疗法常因感染、消化性溃疡等严重不良反应而难以为继。 近些年有使用利妥昔单抗或英夫利昔单抗等生物制剂治疗难治性AIH的报道，但仍存在感染、肝毒性等并发症而加大用药风险[5]。 因此，如何选择治疗方案以提高免疫耐受性的同时减轻副作用将成为治疗AIH 的关键。

miRNA-223 是最早发现的与骨髓系细胞发育密切相关的miRNA 之一，其在骨髓细胞中高度表达，通过外泌体或细胞外囊泡转移的方式调节骨髓祖细胞分化，并调节免疫微环境[6-9]。 miRNA-223 在粒细胞系的分化和成熟过程中增加，其高水平的表达又能进一步促进骨髓祖细胞系向粒细胞的分化和成熟[6，10-11]。 此外，miRNA-223 对粒细胞祖细胞（即MDSC）分化与活化具有抑制作用，对其敲除可促进粒细胞祖细胞数量的扩增。

人参皂苷（ginsenoside, GSS）是人参最主要的活性成分，与糖皮质激素的化学结构以及生物学效应相似[12]。 有大量研究证明，GSS 可通过GR 途径抑制T 细胞的免疫活性，显著减轻由T 细胞过度活化引起的局部炎性浸润与组织损伤[13]。 阻断GR 后，由GR介导生效的途径不会完全削弱，证明在GR 途径外还存在其他途径介导了GSS 对免疫的抑制[14]。GSS 对糖皮质激素（glucocorticoids, GC）具有一定的增效减毒作用。 在长期应用GC 导致GR 表达下降时，GSS的应用除增强GC 的免疫抑制能力外还一定程度逆转了GC 引起的GR 转录与翻译下调[15-18]。 为进一步探究人参皂苷在AIH 中是否有GC 相似的免疫抑制效应，本文使用S-100 诱导的AIH 小鼠模型，观察GSS 对AIH 的调节作用，为AIH 的治疗提供替代药物的新选择。

1 材料与方法

1.1 实验动物

C57BL/6 雄性小鼠购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号码：SCXK（沪）2017-0005。 小鼠饲养于上海市中医医院动物房SPF 级小鼠饲养室，饲养环境为恒温24～27 ℃，湿度50%～80%，饮水与饲料经辐照、高压灭菌不限量供应。本动物实验已通过上海市中医医院实验中心动物实验伦理与福利委员会审核，伦理号：2021019。

1.2 药物与试剂

人参皂苷（上海源叶生物科技有限公司，批号：B30M11C114347）；弗氏完全佐剂（美国Sigma-Aldrich公司，批号：MFCD00131105）；（强）RIPA 裂解液（批号：20101ES60）、TRIzol（批号：19201ES60）、Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix（批号：11184ES03）、脱脂奶粉（批号：36120ES60）、Tween-20（批号：60305ES76）、PMSF（批号：20104ES03）、十二烷基硫酸钠（批号：20106ES76）均购自翌圣生物科技（上海）有限公司；BCA 蛋白浓度测定试剂盒（江苏碧云天生物有限公司，批号：P0012S）；超敏ECL 化学发光液（上海天能科技有限公司，批号：180-5001）；HE试剂盒（生工生物工程（上海）有限公司，批号：E607318-0200）；MEF2C（批号：5030S）、iNOS（批号：13120S）、β-Actin（13E5）（批号：4970S）均购自美国Cell Signaling Technology 公司。

2 实验方法

2.1 动物造模、分组及干预方法

随机选取C57BL/6 同源小鼠6 只作为空白组；参照LOHSE 等[19]描述的实验性AIH 小鼠模型制备方法进行造模。 造模方法如下：选取C57BL/6 同源小鼠应用抗原S-100 与弗氏佐剂完全研磨乳化后腹腔注射，0.2 mL/20 g，每周1 次，第7 天再次注射加强免疫炎症反应，第14 天即造模完成。 造模成功的模型小鼠随机分为模型组、人参皂苷(AIH+GSS)组与阳性对照地塞米松(AIH+DEX)组，每组6 只。造模过程中空白组小鼠腹腔注射PBS，0.2 mL/20 g，每周1 次，共2 次。 在第14 天造模完成后，空白组、模型组予无菌蒸馏水灌胃200 μL/20 g，AIH+GSS组予人参皂苷50 mg/kg 等容量灌胃，AIH+DEX 组予地塞米松1 mg/kg、200 μL/20 g 腹腔注射。每天1 次，共14 d。

2.2 外泌体分离

摘取小鼠眼球取血，向血液中加入EDTA-2K抗凝，离心半径8.7 cm，3000 r/min 4 ℃15 min 离心，收集上清液于液氮中冻存备用；将血浆用PBS以1∶2 进行稀释，以离心半径8.7 cm，2000 r/min 4 ℃10 min 离心后取上清液至新离心管，并加入样本1/2体积的沉淀试剂，涡旋震荡混匀后4 ℃60 min 孵育；孵育结束后以离心半径8.7 cm，10 000 r/min 15 min离心，弃尽上清液；以预冷PBS 清洗管壁及管底白色沉淀后，以原始血浆容量用PBS 进行吹打复溶，富集的外泌体。

2.3 MDSC 细胞、Treg 细胞、Th17 细胞染色

收集部分细胞至流式管中计数，调整至1×106个/管，加入PBS 离心，弃上清液；加100 μL PBS 重悬，分别加入流式抗体CD11b、Gr-1、CD4 和CD25，避光孵育；加入PBS 1 mL/管，离心弃上清液。检测MDSC 细胞：取250 μL PBS 重悬细胞后进行流式检测。 检测Treg 细胞：加PBS 重悬细胞，每管加入1 mL固定/破膜缓冲液，混匀后避光孵育，离心弃上清液。于100 μL 破膜液中重悬细胞，加入抗体Foxp3，避光孵育，离心弃上清液。 取破膜液重悬细胞后进行流式检测。 检测Th17 细胞：以完全培养基重悬细胞，按说明书加入500×eBioscience Cell Stimulation Cocktail，37 ℃培养箱培养6 h；将细胞收集至流式管中，加入PBS 1 mL/管，离心弃上清；加PBS 重悬，加入流式抗体IL-17A，避光孵育；加入PBS，离心弃上清，此步骤重复2 次；加PBS 重悬细胞后进行流式检测。

2.4 Western blot 分析

使用RIPA 裂解液提取肝脏组织蛋白后，BCA蛋白试剂盒检测蛋白含量。 样品蛋白中加入适量5×SDS loading buffer，在100 ℃的金属浴锅加热5 min。 使用SDS-PAGE 凝胶进行电泳分离胶分离蛋白，并转移至0.45 μm 孔径的PVDF 膜。 条带浸没在封闭液中室温慢摇3 h，封闭完成后，使用TBST 配制适合浓度的一抗，将目标条带浸没于一抗中，4 ℃孵育过夜，用TBST 漂洗3 次。 使用TBST 配制适合浓度的HRP 标记二抗，将目标条带浸于二抗中，室温慢摇孵育1 h。 用TBST 漂洗后，ECL 显色液覆盖全膜。 最后应用Bio-Rad ChemiDocTM XRS+系统与Image Lab 软件曝光。

2.5 染料法荧光定量PCR

提取肝脏组织总RNA，测各样本RNA 浓度及纯度。 在每个离心管中加入1 μg RNA 样本，5×gDNA wiper Mix 3 μL，RNase freeH2O 补足至15 μL，42 ℃水浴加热2 min；在上述15 μL 体系中加入5 μL 的4×Hifair R○ⅢSuperMix plus。反应条件：25 ℃，5 min，55 ℃，15 min，85 ℃，5 min 得到的cDNA-20 ℃保存备用。 在离心管中加入Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix 10 μL，加正反向引物各0.4 μL(引物见表1)， 加入cDNA 模板2 μL，ddH2O 补足至20 μL，混匀。按照说明书设置反应条件，实施上机检测，用相对表达量=2-△△Ct公式计算各个组的表达情况。

表1 引物序列

2.6 小鼠肝功能与肝组织病理学检测

使用ALT/GPT 检测试剂盒检测小鼠血清ALT水平，AST/GOT 检测试剂盒检测AST 水平。用4%的多聚甲醛将肝组织固定24 h 后，按照相应的步骤进行脱水至蜡并包埋，切片5 μm，制白片后烤干备用，染色前将白片按相应顺序脱蜡至水使用。 采用HE 染色与Masson 染色，染色后使用显微镜观察小鼠肝组织的变化。

2.7 统计方法

流式数据使用CytExpert 分析结果，PCR 结果使用相对定量法计算Ct 值，将结果导入GraphPad Prism 8 绘制统计图，并使用ANOVA 进行多样本配对分析，均采用双侧检验。 Western blot 结果导入ImageJ 软件测算灰度值并以GraphPad Prism 8 统计分析绘图。 在α=0.05 水准上，当P＜0.05 为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 人参皂苷对AIH 小鼠肝功能的影响

模型组小鼠血清ALT、AST 水平较空白组均显著升高（P＜0.001）；AIH＋DEX 组小鼠血清ALT、AST浓度较模型组显著降低（P＜0.001），与空白组无明显差异(P＞0.05）；AIH＋GSS 组ALT 与AIH＋DEX 组无明显差异（P＞0.05），AST 显著低于模型组（P＜0.001），略高于DEX 组（P＜0.01）。 详见表2。

表2 人参皂苷对AIH 小鼠转氨酶的影响（U/L，±s，n=6）

表2 人参皂苷对AIH 小鼠转氨酶的影响（U/L，±s，n=6）

注：与空白组比较，△△△P＜0.001；与模型组比较，***P＜0.001；与AIH＋DEX 组比较，##P＜0.01。

组别转氨酶活力ALT AST空白组模型组AIH＋DEX 组AIH＋GSS 组F 值P 值12.18±0.64 14.72±0.50△△△12.22±0.53***12.30±0.56***20.83＜0.0001 23.76±3.26 36.71±1.04△△△21.30±1.29***27.33±3.22***##46.14＜0.0001

在对小鼠肝脏进行HE、Masson 染色检查肝脏损伤情况中发现，对照组小鼠肝细胞与肝小叶形态正常，界面区无炎细胞浸润，无胶原纤维增生；模型组肝界面区炎性细胞浸润严重，肝细胞坏死严重，小叶形态异常，有明显胶原纤维增生；AIH＋DEX 组与AIH＋GSS 组界面区炎细胞浸润明显减少，小叶形态较正常，胶原纤维增生较少。 详见图1。

图1 人参皂苷对AIH 小鼠肝脏病理的影响

3.2 人参皂苷对免疫微环境的调节功能

模型组小鼠MDSC 细胞数量较空白组显著下降（P＜0.001），Treg 细胞数量较空白组显著下降（P＜0.01），Th17 细胞数量较空白组显著上升，差异具有统计学意义（P＜0.001）；经AIH＋DEX 干预后，MDSC、Treg 细胞数量高于模型组，Th17 细胞数量下降，差异具有统计学意义（P＜0.01）；AIH＋GSS 组MDSC 细胞数量高于模型组（P＜0.001），Treg 细胞数量高于模型组（P＜0.05），Th17 细胞数量低于模型组（P＜0.05）。 详见图2。

图2 人参皂苷对AIH 小鼠免疫细胞的影响

3.3 人参皂苷对miRNA-223 表达的影响

模型组miRNA-233 表达显著高于空白组（P＜0.001）；AIH＋GSS 组与AIH＋DEX 组miRNA-223 的表达水平均显著低于模型组（P＜0.001），而两组间差异无统计学意义（P＞0.05）。 详见表3。

表3 人参皂苷对miRNA-223 水平的影响（±s，n=6）

表3 人参皂苷对miRNA-223 水平的影响（±s，n=6）

注：与空白组比较，△△△P＜0.001；与模型组比较，***P＜0.001。

miRNA-223 1.01±0.01 2.08±0.33△△△0.67±0.04***0.74±0.05***88.66＜0.0001组别空白组模型组AIH＋DEX 组AIH＋GSS 组F 值P 值

3.4 人参皂苷对MDSC 相关蛋白及其对GR 的影响

模型组Arg-1、iNOS 转录水平较空白组显著降低（P＜0.001）；AIH＋DEX 组与AIH＋GSS 组Arg-1、iNOS 转录水平均显著高于模型组（P＜0.001），其中，AIH＋GSS 组Arg-1、iNOS 转录水平略高于AIH＋DEX组（P＜0.01）。 详见表4。

表4 人参皂苷对MDSC 功能蛋白的影响（±s，n=6）

表4 人参皂苷对MDSC 功能蛋白的影响（±s，n=6）

注：与空白组比较，△△△P＜0.001；与模型组比较，***P＜0.001；与AIH＋DEX 组比较，##P＜0.01。

组别 Arg-1 mRNA iNOS mRNA空白组模型组AIH＋DEX 组AIH＋GSS 组F 值P 值1.00±0.00 0.40±0.13△△△1.30±0.25***1.78±0.14***##80.04＜0.0001 1.00±0.00 0.44±0.04△△△1.53±0.10***2.25±0.38***##90.5＜0.0001

模型组小鼠iNOS、Arg-1、MEF2C 与GR 蛋白表达水平均较空白组显著下降(P＜0.001)，而AIH＋DEX或AIH＋GSS 干预后表达水平均有明显上升(P＜0.001)。详见表5 和图3。

图3 人参皂苷对相关蛋白表达的影响

表5 人参皂苷对相关蛋白表达的影响（灰度值，±s，n=3）

表5 人参皂苷对相关蛋白表达的影响（灰度值，±s，n=3）

注：与空白组比较，△△△P＜0.001；与模型组比较，***P＜0.001，**P＜0.01。

组别 iNOS GR MEF2C Arg-1空白组模型组AIH＋DEX 组AIH＋GSS 组F 值P 值1.00±0.03 0.47±0.01△△△1.28±0.11***0.98±0.04***93.94＜0.0001 1.00±0.12 0.52±0.06△△△0.96±0.06***0.90±0.08**20.97 0.0004 1.00±0.04 0.35±0.02△△△0.70±0.03***0.70±0.02***257.7＜0.0001 1.00±0.02 0.51±0.01△△△0.98±0.05***0.83±0.02***183.8＜0.0001

4 讨论

AIH 是一种自身免疫反应介导的界面型肝炎，因Th17 为首的辅助性T 细胞受到异常激活并不断损伤肝细胞所致。有大量研究证实，MDSC 细胞拥有对T 细胞较强的抑制能力，可以很好地减轻因辅助性T 细胞过度活化对机体的损伤，而与骨髓细胞发育高度相关的miRNA-223 对MDSC 的增殖起决定性作用[6，10-11，26-27]。 系统性自身免疫性疾病中抗原呈递细胞将自身抗原肽呈递并激活初始CD4＋T 辅助(Th0)细胞，Th0 细胞迅速活化为Th1、Th2、Th17细胞并大量释放促炎细胞因子并诱导了机体正常组织炎性损伤，这也是AIH 的发病机制之一[20-21]。 在此过程中，标记为CD4＋CD25＋FOXP3＋Treg 细胞的分化受损常被认为是自身免疫系统疾病发生的关键[22]。在AIH 患者外周血中Treg 细胞功能受损，Foxp3 表达明显降低[23]。 MDSC 细胞拥有抑制T 细胞增殖和诱导细胞毒性T 淋巴细胞活性的能力[24-25]。 并且MDSC细胞通过特异性高表达Arg-1、iNOS 酶分别产生尿素、L-鸟氨酸和NO 来抑制T 细胞活性[26-27]。 肌细胞增强因子2 家族蛋白(myocyte enhancer factor-2,MEF2)作为控制基因表达与表观遗传修饰的转录因子，其家族亚型在不同组织中的表达水平表现出一定的异质性[28]。 其中，MEF2C 亚型在骨髓细胞中特异性表达并广泛参与了骨髓祖细胞的增殖、分化与成熟，对免疫系统调节有至关重要的作用[6，28-29]。 在一项对骨髓细胞分化及粒细胞功能调节的研究中发现，MEF2C 是潜在的对MDSC 细胞分化增殖调控的靶点[6]。

在本课题组前期对临床AIH 患者的证候研究中发现，患者求诊时常以脾虚生湿、湿郁化热之面色萎黄、乏力倦怠、舌苔黄厚腻有齿痕等表现为主，土壅木郁化热而又见胁肋闷痛不适等，又或发黄疸等症。 AIH 的病因病机可归纳为先天禀赋不足，或劳伤脾胃，乃至脾胃运化失司，水谷生湿化热，蕴结成毒；中焦受气取汁，变化而赤，是谓血，脾虚令中焦气机失运，则气血生化不足，又肝体阴而用阳，若肝失阴血滋养则气不涵养而化火灼津，反伤于肝而成AIH。 其中，肝郁脾虚，气滞、湿热与邪毒令本病虚实夹杂，缠绵难愈。总结出本病之病位在肝，而根本在乎脾与肾，以脾肾虚为本，湿热瘀邪为标。 因此，以人参为核心立方，辅以疏肝祛邪，养护中土，健运脾胃，以行散中焦湿阻，肝气无湿阻则与脾气升降运行，周身大气一转，正气充盛则邪气散而AIH 得愈。

人参大补肺脾肾元气，能充养正气而祛邪外出，而人参皂苷是其中发挥补益元气最主要的药效成分，目前已发现的皂苷类单体已多达30 余种[30]。 目前已有较多关于人参皂苷扶正祛邪的功效在免疫学方面的研究，如人参皂苷Rg3 可呈剂量依赖性激活IL-12 途径诱导树突状细胞的成熟与下调CD4+T 细胞[31-32]，Rh2 可 通 过 增 强CD4+、CD8+T 细 胞 活 性 并诱导T 细胞向肿瘤细胞周围浸润[33]，Rg3 可通过激活巨噬细胞吞噬活性，激活CD4+T 细胞活性，促进IFN-γ、TNF-β、IL-2 等细胞因子增强机体免疫功能[34-35]等。 人参皂苷不同单体在不同的疾病中常可表现出不同的免疫调节能力[36]，总体而言这种对免疫双向调节的能力都可归纳为中医理论的扶正祛邪。正所谓“正气内存，邪不可干”，于宏观而言，人参对机体的调补之功，乃补气生津，安神益智；于微观言，这种补摄之能不再局限于传统的“补”，而在于“阴平阳秘，精神乃治”；免疫过强，则“阳强不能密，阴气乃绝”，人参有选择性地降低过高的免疫水平，提高过低的免疫水平，使机体免疫处于健康平和的状态，则阴阳平和，相互协调，其人气实而难生AIH。

有研究表明，人参皂苷对机体的调节活性与GC相似，大多是通过GR 实现的[37]，这或与人参皂苷拥有与GC 相似的甾体样化学结构有关[12]。自身免疫性疾病患者临床一线用药以地塞米松、泼尼松龙等GC为主。 有中医学者认为，糖皮质激素之于人体，有补火助阳之功，少用可“少火生气”，温煦脏腑，运行气血，补元阳而散阴寒；峻用、久用则“壮火食气”，煎灼津液，耗伤精髓[38-39]。 长期GC 用药除产生一系列严重不良反应外，还会降低GR 表达与活性，最终导致GC 耐受[40-41]。 这也与GC 的“少火生气，壮火食气”相似。 但研究指出，人参皂苷可通过上调GR 表达水平、增强GR 与GC 的结合活力、辅助GR 对下游通路的激活效应等方式减轻由GC 带来的不良反应，并对GC 增效减毒[30]。 但目前尚未有研究表明人参皂苷也通过激活GR，对AIH 有相同的免疫调节作用。 因此，我们设立地塞米松为阳性对照，观察人参皂苷对AIH 小鼠的影响。 实验结果表明，人参皂苷可通过上调GR 的表达，增强Arg-1、iNOS 的转录与表达，促进MDSC 与Treg 的表达，抑制Th17 细胞的数量，调整肝脏的免疫微环境。 这种人参皂苷对免疫细胞的调节与糖皮质激素相似，均可调节小鼠免疫微环境，缓解AIH 肝脏中T 效应细胞带来的肝脏损伤。 同时，在应用人参皂苷或地塞米松后MEF2C的表达量均有所提升。 由此推测，人参皂苷对MDSC的激活作用或与其对MEF2C 的激活有关。 此外，在对外周血外泌体的miRNA 检测中，本研究表明人参皂苷与地塞米松均对miRNA-223 表现出良好的抑制作用。 实验结果表明人参皂苷对AIH 小鼠的保护作用或通过对miRNA-223 的抑制与对GR 与MEF2C 的激活实现，据此实现对MDSC 的扩增与对肝脏免疫微环境的调节。

虽然在我们的实验中人参皂苷对AIH 中肝脏的保护作用略低于AIH+DEX，且应用剂量远大于后者，但鉴于人参皂苷在一定剂量的应用尚未有严重不良反应报道，对比GC 长期、大剂量应用带来的严重不良反应，人参皂苷或能成为GC 之后新的替代选择。