布比卡因对肝癌HepG2细胞增殖、侵袭和凋亡及miR-191/KLF6信号轴的影响*

张振翼 袁增江 张 欣 赵孟雷 徐殿国

1.邯郸市中心医院普外科 (河北 邯郸，056000) 2.河北工程大学医学院人体解剖教研室

肝癌是一种常见的恶性肿瘤，由于其高转移潜力，已成为癌症相关死亡的主要原因[1]。尽管在肝癌的诊断和治疗方面已经取得了很大的进步，但是患者的预后仍较差[2]。因此，探索其潜在的病理机制对于寻找可以改善肝癌患者治疗水平的新策略尤为重要。微小RNA(miRNA)作为基因表达的转录后调节因子，通过靶向蛋白质编码基因的3'-非翻译区(3'-UTR)发挥其功能，该蛋白参与调节众多生物学过程。研究证实在多种人类癌症中都发现了改变的miRNA水平，并且在肿瘤发生中起着关键作用[3]。微小RNA-191(miR-191)作为一种高度保守的血清外泌体miRNA，在20多种不同的癌症类型中均异常表达，也是肝细胞癌(HCC)治疗的潜在致癌靶标。在HCC癌细胞中，miR-191被证明具有调节作用，通过DNA甲基化并参与上皮间质转化(EMT)的调控[4]。Krüppel样因子(KLF)属于控制基本细胞过程的锌指转录因子家族。KLF6是KLF家族的成员，在细胞生长和细胞周期进程中起着至关重要的作用[5]。研究表明，KLF6抑制了细胞周期蛋白D的表达，导致HCC衍生细胞中的G1细胞周期停滞[6]。有研究报道，布比卡因可抑制胰腺癌细胞和人前列腺癌细胞侵袭、迁移和增殖[7,8]。目前尚无关于布比卡因对肝癌细胞作用机制的研究，本研究拟探讨布比卡因对肝癌HepG2细胞增殖、侵袭和凋亡及miR-191/KLF6信号轴的影响，为肝癌的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验细胞、试剂及仪器 肝癌HepG2细胞系(上海汉博生物科技有限公司，批号SCSP-917)，布比卡因(岳阳市嘉诚生物科技有限公司，原料药，纯度99%，批号2180-95-3)，顺铂注射液(江苏豪森药业集团有限公司，批号20200516)，胎牛血清(FBS)、DMEM培养基、细胞计数试剂盒8(CCK-8)、膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)细胞凋亡试剂盒(北京泰泽嘉业科技发展有限公司，批号YH5778、YH6019、YH7119、YH5007)，TRIzol试剂、TAQMAN MICRORNA定量PCR试剂盒、裂解缓冲液、蛋白含量测定试剂盒、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(北京百奥莱博科技有限公司，批号BL-11335、BL-16472、BL-20176、BL-20135、BL-30017)，兔抗KLF6抗体、兔抗GAPDH抗体、山羊抗兔二抗、增强的化学发光试剂盒(上海恪敏生物科技有限公司，批号BY-5784R、BY-0844R、EM-1009、BY-2911R)，CO2细胞培养箱(美国Thermo公司，型号240i)，酶标仪(上海宝予德科学仪器有限公司，型号K3 Plus)，Transwell小室(北京优尼康生物科技有限公司，型号3415)，光学显微镜(德国LIOO公司，型号JDS300)，流式细胞仪(广州吉源生物科技有限公司，型号CyFlow Cube6)，荧光定量PCR系统(杭州博日科技股份有限公司，型号FQD-16A)，凝胶成像系统(杭州汇尔仪器设备有限公司，型号GIS300)。

1.2 细胞培养及分组 肝癌HepG2细胞复苏后，加入到含有10% FBS的DMEM培养基中，并在37℃、5% CO2培养箱中培养，细胞覆盖率为70%左右时使用胰蛋白酶消化、传代。

将肝癌HepG2细胞随机分为肝癌HepG2细胞组、顺铂组(3.0 μg/ml)[9]、布比卡因低剂量组(2.5 mg/ml)、布比卡因高剂量组(5.0 mg/ml)[8]。

肝癌HepG2细胞组：肝癌HepG2细胞液(细胞浓度为5×106个/ml)在10% FBS的DMEM培养基中培养。顺铂组、布比卡因低剂量组、布比卡因高剂量组：细胞培养方法同肝癌HepG2细胞组，分别加入浓度为3.0 μg/ml的顺铂、2.5 mg/ml、5.0 mg/ml的布比卡因。以上各组设8个平行样，培养72 h。

1.3 细胞增殖测定 各组肝癌HepG2细胞培养结束后，在96孔板中每孔加入1×104个肝癌HepG2细胞，48 h后加入10 μl CCK-8试剂，在37℃下放置4 h后，使用酶标仪在450 nm处测量吸光度(OD)，根据OD计算细胞存活率，另设空白对照组(只加培养液、CCK-8试剂)，细胞存活率=实验组OD/空白对照组OD×100%。

1.4 细胞侵袭水平测定 各组肝癌HepG2细胞培养结束后，将肝癌HepG2细胞(8×103个/ml)接种在基质胶包被的Transwell小室上腔中，将含有10% FBS的DMEM培养基添加到Transwell小室下腔中，在37℃下培养24 h后，将上腔室中的细胞移出，并将下腔室中的细胞在室温下使用0.1%结晶紫染色30 min，随机选取6个视野用显微镜计数穿膜细胞，实验重复3次，取平均值。

1.5 细胞凋亡水平测定 各组肝癌HepG2细胞培养结束后，用胰蛋白酶消化并用PBS洗涤两次，将细胞用70%的冰冷乙醇固定，重悬于PBS中，采用Annexin V-FITC/PI试剂盒于流式细胞仪上检测细胞凋亡情况。

1.6 细胞miR-191、KLF6 mRNA水平测定 使用TRIzol试剂从肝癌HepG2细胞中分离总RNA，将其逆转录成cDNA，使用TAQMAN MICRORNA定量PCR试剂盒在实时荧光定量PCR系统上进行反应。引物由上海康成生物工程有限公司设计并合成。引物序列如下：miR-191正向5′-GCATCCTGACGTGTCAGACTA-3′，miR-191反向5′-TACGACGATACGGGATAAGTC-3′；KLF6正向5′-GCAATACTCGCCTTACGGCT-3′，KLF6反向5′-TACACACCTTGTAGTACGCC-3′；GAPDH正向5′-ACAAC-TTTGGTATCGTGGAAGG-3′，GAPDH反向5′-GACCTAGATGGCCTAAACGCTT-3′；热循环的条件：95℃ 5 min，95℃ 15 s共40个循环，60℃ 30 s退火/延伸。使用2-ΔΔCt方法计算miR-191、KLF6 mRNA的相对表达水平。

1.7 细胞KLF6蛋白水平测定 使用裂解缓冲液裂解肝癌HepG2细胞，提取总蛋白，测定蛋白含量之后通过凝胶电泳分离蛋白质(50 μg/泳道)，并转移到PVDF膜上，在室温下用5%脱脂奶封闭膜3 h，将兔抗KLF6抗体(1∶500)和GAPDH抗体(1∶500)在4℃下与PVDF膜孵育过夜，用PBS洗涤3次后，将膜与山羊抗兔二抗孵育3 h，使用增强的化学发光试剂盒和Quantity One软件分析蛋白质条带的灰度值。

2 结果

2.1 各组肝癌HepG2细胞存活率、穿膜数、凋亡率比较 见表1，显微镜下计数穿膜细胞见图1。流式细胞仪上检测的细胞凋亡情况见图2。

表1 各组肝癌HepG2细胞存活率比较

图1 各组肝癌HepG2细胞穿膜数比较(结晶紫染色，×200) (A：肝癌HepG2细胞组，B：顺铂组，C：布比卡因低剂量组，D：布比卡因高剂量组)

图2 各组肝癌HepG2细胞凋亡率比较 (A：肝癌HepG2细胞组，B：顺铂组，C：布比卡因低剂量组，D：布比卡因高剂量组)

2.2 各组肝癌HepG2细胞miR-191、KLF6 mRNA水平及KLF6蛋白水平比较 见表2。KLF6蛋白印迹图见图3。

表2 各组肝癌HepG2细胞miR-191、KLF6 mRNA水平比较

图3 各组肝癌HepG2细胞KLF6蛋白印迹图 (A：肝癌HepG2细胞组，B：顺铂组，C：布比卡因低剂量组，D：布比卡因高剂量组)

3 讨论

布比卡因作为一种临床局部浸润麻醉药物，最近的一些研究集中于其对癌细胞的潜在细胞毒性。Liu等[10]研究表明，布比卡因可通过调节核因子κB(NF-κB)信号通路抑制人结肠癌细胞增殖，促进其凋亡和自噬。Ju等[11]研究表明，布比卡因可降低胃癌细胞中环状RNA 0000376(circRNA0000376)表达，提高微小miR-145-5p表达，进而抑制胃癌进展。有研究显示布比卡因可呈剂量依赖性上调腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)表达进而抑制人膀胱癌细胞增殖，并诱导细胞凋亡[12]。鹿素青等[13]研究表明，布比卡因可能通过促进miR-381-3p表达，抑制E3泛素连接酶(HERC4)表达，进而抑制肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。这些研究均表明布比卡因具有抗癌作用，可有效抑制癌细胞的发展。本研究结果显示，布比卡因低、高剂量组肝癌HepG2细胞存活率、穿膜数低于肝癌HepG2细胞组，凋亡率高于肝癌HepG2细胞组；且布比卡因高剂量组肝癌HepG2细胞存活率、穿膜数低于布比卡因低剂量组，凋亡率高于布比卡因低剂量组。这与上述研究结果一致，说明布比卡因能明显抑制肝癌HepG2细胞增殖、侵袭，促进其凋亡。

肝癌的发生和发展涉及多种基因和环境因素，这些与许多病理过程和分子事件有关。miRNA参与肿瘤发生和进展，某些miRNA会提高肿瘤的侵袭和转移能力，从而起到致癌性miRNA的作用；另外一些miRNA会抑制肿瘤的发生、发展和侵袭，并起抑癌性miRNA的作用[14]。而miR-191可发挥促癌作用，张琳琳等[15]临床研究表明上皮性卵巢癌患者血浆miR-191表达水平明显高于上皮卵巢良性肿瘤患者和健康体检者。Hu等[16]研究表明，miR-191在宫颈癌细胞中高表达，抑制miR-191表达可降低宫颈癌细胞存活、转移，促进宫颈癌细胞凋亡。临床研究表明，胃癌患者血清中miR-191表达与正常人相比明显上调，且miR-191高表达是化疗不敏感的独立危险因素，miR-191高表达患者预后生存率较低[17]。本研究结果显示，布比卡因低、高剂量组肝癌HepG2细胞中miR-191水平低于肝癌HepG2细胞组，布比卡因高剂量组肝癌HepG2细胞中miR-191水平低于布比卡因低剂量组。表明布比卡因可抑制肝癌HepG2细胞中miR-191表达，进一步提示布比卡因对肝癌HepG2细胞增殖、侵袭的抑制作用和对凋亡的促进作用，可能与其抑制miR-191的表达有关。

KLF6是一种抑癌基因。有学者研究表明宫颈癌组织KLF6高表达者化疗敏感性高，且预后更好，KLF6可作为患者预后评价指标[18]。张倬等[19]研究显示，食管癌细胞中KLF6 mRNA和蛋白表达下调，抑制miR-24-3p表达可上调KLF6 mRNA和蛋白表达，从而抑制食管癌细胞活力，诱导其凋亡。研究表明，抑制环状RNA-SMAD7表达可使KLF6的mRNA和蛋白表达均显著增加，卵巢癌细胞的迁移和侵袭受到明显抑制[20]。相元翠等[21]研究表明，KLF6基因可通过磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信号通路抑制宫颈癌细胞增殖，诱导细胞凋亡。以上研究均表明KLF6具有抑癌作用，可有效抑制癌细胞的发展。KLF6是miR-191的潜在靶标，荧光素酶报告系统验证了miR-191和KLF6基因之间的相互作用[4]。本研究结果显示：布比卡因低、高剂量组肝癌HepG2细胞中KLF6 mRNA和蛋白水平高于肝癌HepG2细胞组，布比卡因高剂量组肝癌HepG2细胞中KLF6 mRNA和蛋白水平高于布比卡因低剂量组。说明布比卡因可促进肝癌HepG2细胞中KLF6的表达，而KLF6 mRNA和蛋白水平的升高可能与布比卡因抑制miR-191的表达有关。

综上所述，布比卡因能明显抑制肝癌HepG2细胞增殖和侵袭，促进其凋亡；其机制可能与布比卡因降低肝癌HepG2细胞miR-191的表达进而促进KLF6的表达有关。