TLR10基因多态性与HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者PEG-IFNα治疗临床转归的相关性分析*

范敬静 常彩芳 陈 宇 韩永平 刘金禄 周小英 白 雪

1.河北北方学院附属第一医院感染内科 (河北 张家口，075000) 2.河北北方学院附属第一医院微生物科

慢性乙型肝炎(CHB)是因感染乙型肝炎病毒(HBV)所致，若不及时治疗，可能发展为肝硬化和肝癌，严重威胁患者的生命安全。抗病毒治疗是改善CHB患者预后的有效措施之一，主要是通过乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)清除和血清学转换达到治疗的目的[1,2]。聚乙二醇化干扰素α(PEG-IFNα)是治疗HBeAg阳性CHB患者的有效方式之一，可通过作用于HBV逆转录酶或DNA聚合酶，抑制HBV复制，延缓疾病进展，提高患者生活质量，但CHB患者的药物耐受一直是临床治疗难点。既往研究报道抗病毒治疗的疗效及耐药突变密切相关，某些耐药基因可导致HBV耐药突变，进而增加治疗难度[3,4]。Toll样受体10(TLR10)基因是一种无特异性配体的寡受体，可通过与TLR2作用对下游白细胞介素-1分泌进行调控，介导信号通路抑制HBV复制。TLR2与HBV感染密切相关，但TLR10基因多态性在HBV感染过程中的免疫应答作用机制的相关报道较为少见[5,6]。基于此，研究以92例HBeAg阳性CHB患者作为研究对象，予以PEG-IFNα治疗，检测TLR10基因多态性并分析其与患者免疫应答的关系，为临床治疗方案的制定提供指导依据。

1 资料与方法

1.1 基本资料 选取我院2019年8月至2020年8月收治的92例HBeAg阳性CHB患者作为研究对象，其中男52例，女40例；年龄23～79岁，平均(48.43±3.22)岁。本研究获得我院伦理委员会批准。

1.2 纳入及排除标准 纳入标准：①符合《CHB防治指南》[7]中诊断标准，经常规乙型肝炎标志物检测确认为HBeAg阳性者，年龄>18岁；②临床资料完整；③入组前未使用抗病毒药物；④患者或家属知情且签署知情同意书。排除标准：①合并全身性感染、免疫系统疾病者；②药物或饮酒导致的肝功能异常者；③认知障碍或精神疾病者；④拒绝或不配合研究患者。

1.3 治疗方案及分组 患者均进行PEG-IFNα治疗，治疗6个月后患者血清HBV DNA<2 000 IU/ml且达到HBeAg、乙型肝炎e抗体(HBeAb)血清转换者为应答组(44例)，未达到以上标准为非应答组(48例)。

1.4 观察指标及研究方法

1.4.1 一般资料及生化指标 收集两组患者性别、年龄等资料，并取患者清晨空腹静脉血约3 ml，使用湖南圣湘生物科技有限公司试剂盒，采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测患者HBV DNA载量。使用厦门英科新创科技有限公司试剂盒，采用7180型全自动生化分析仪检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)，天门冬氨酸氨基转移酶(AST)。

1.4.2 TLR10基因RS10004195位点基因型和等位基因检测 取患者清晨空腹静脉血约3 ml，置于含有乙二胺四乙酸二钠的抗凝管内，于-80℃保存，使用上海捷瑞生物工程有限公司1408G26型全血基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取，核酸定量分析仪检测DNA浓度。然后进行PCP扩增，扩增体系为：DNA模板0.5 μl，10×缓冲液2.5 μl，MgCl25 mmol/L，引物0.5 μl，dNTP 0.5 μl，TaqDNA聚合酶0.25 μl。TLR10基因RS10004195位点上游引物为 5′-CCTGGGTGACAAAGTGAGACCCTACCT-3′，下游引物为5′-CTTAAACCCCATCCGCCCTCTT-3′；扩增产物由上海桑尼生物科技有限公司进行基因序列分析。分析TLR10基因RS10004195位点TT(野生型)、AA+AT(变异型)基因分布频率，及A、T等位基因频率分布情况，探讨基因型分布频率和等位基因频率在不同免疫应答患者中分布情况。

1.4.3 TLR10基因RS11096957位点基因型和等位基因检测 TLR10基因RS11096957位点上游引物为5′-CTTAAACCCCATCCGCCCTCTT-3′，下游引物为5′-GTAGCCTGCCCATCTTAAACAC-3′。PCR反应条件：95℃预变性 2 min，94℃变性45 s，58℃退火90 s，72℃延伸2 min，共35个循环95℃预变性 2 min，94℃变性45 s，56℃退火90 s，72℃延伸2 min，共35个循环。检测TLR10基因RS11096957位点CC(野生型)、AC+AA(变异型)基因分布频率，及A、C等位基因频率分布情况，探讨基因型分布频率和等位基因频率在不同免疫应答患者中分布情况。

1.4.4 TLR10基因多态性与临床转归的相关性 以HBeAg阳性CHB患者PEG-IFNα治疗后是否发生免疫应答为自变量(0=非应答，1=应答)，以TLR10基因中A基因型携带、A等位基因频率分布为因变量，分析TLR10基因RS10004195位点和RS11096957位点基因型分布频率和等位基因频率与免疫应答的关系，分析 LR10基因多态性与HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者PEG-IFNα治疗临床转归的关系。

2 结果

2.1 两组患者基本资料比较 两组患者性别、年龄、HBV DNA载量、ATL、AST水平差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 两组患者一般资料比较

2.2 两组患者TLR10基因RS10004195位点基因型和等位基因频率分布比较 TLR10基因RS10004195位点基因型Hardy-Weinberg平衡分析显示，研究人群不具有特异性(χ2=3.18，P=0.105)，应答组AA+AT型基因分布频率(77.27%)显著高于非应答组(52.08%)，A等位基因频率(65.91%)显著高于非应答组(41.67%)，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 两组患者TLR10基因RS10004195位点基因型和等位基因频率分布比较 [例(%)]

2.3 两组患者TLR10基因RS11096957位点基因型和等位基因频率分布比较 TLR10基因RS11096957位点基因型因型Hardy-Weinberg平衡分析显示，研究样本能够代表总体(χ2=4.09，P=0.078)。应答组AC+AA型基因分布频率(70.45%)与非应答组(62.50%)的差异无统计学意义(P>0.05)；而应答组A等位基因频率(61.36%)显著高于非应答组(39.58%)，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 两组患者TLR10基因RS11096957位点基因型和等位基因频率分布比较 [例(%)]

2.4 TLR10基因多态性与HBeAg阳性CHB患者PEG-IFNα治疗临床转归的相关性 TLR10基因RS10004195位点中，A型基因，A等位基因频率和RS11096957位点中A等位基因频率是HBeAg阳性CHB患者PEG-IFNα治疗临床转归的独立危险因素(OR>1，P<0.05)，见表4。

表4 TLR10基因多态性与HBeAg阳性慢性CHB患者PEG-IFNα治疗临床转归的相关性

3 讨论

CHB患者的治疗过程中通过抑制HBV DNA聚合酶来持续降低血清HBV DNA水平，促进ALT正常，进而改善患者肝脏组织学病变，阻止病情进展。HBV诱导的免疫应答是造成肝脏损伤和炎症的主要原因，宿主通过免疫反应来清除病毒，病毒通过免疫逃逸来避免清除，进而保持免疫应答的平衡[8,9]。而基因型突变后导致HBV清除能力改变，进而导致免疫应答能力改变，从而影响影响抗病毒治疗应答和病毒的清除[10,11]。本次研究中TLR10基因RS10004195位点A型基因，A等位基因频率突变，及RS11096957位点中A等位基因频率是导致PEG-IFNα治疗后临床归转的独立危险因素，其基因表达与HBeAg阳性CHB患者免疫应答密切相关，可为临床基因调节治疗提供理论基础。

本次研究结果显示，TLR10基因RS10004195位点基因型中，应答组AA+AT型基因分布频率为77.27%显著高于非应答组的52.08%，A等位基因频率(65.91%)显著高于非应答组(41.67%)，说明应答免疫组患者TLR10基因RS10004195位点(AA+AT)变异型基因和A等位基因频率分布频率较高，这可能与A型基因发生突变后可能导致病毒清除能力和免疫应答能力改变，提示TLR10可能参与了HBV相关的免疫反应。A型基因携带者在基因突变后导致HBV核心启动，进而促进HBV复制水平提高，推测A型基因促进免疫应答，参与肝纤维化和炎症反应过程[12,13]。究其原因，不同HBV基因型对不同抗HBV药物耐受程度不同，进而对患者机体免疫应答产生不同影响。HBeAg阳性患者的肝细胞、库否细胞等过促进Th17细胞分化和外周血单个核细胞应答参与疾病进展，HBsAg可通过阻断JNK-MAPK信号通路抑制巨噬细胞分泌炎性因子而躲避免疫攻击，进而影响抗病毒治疗应答和病毒的清除[14,15]。T细胞的应答增强可促进HBV清除，而信号途径被阻断导致相关基因的转录翻译过程被改变，病毒抑制或清除的作用被削弱[16,17]。因此，免疫应答在CHB患者病情发展具有重要意义。TLR10在B细胞核树突状细胞中表达，可通过MyD 88信号通路介导下游炎性因子分泌，调节T细胞，促进TLR10表达，在缺氧或活性氧氧功能增强时TLR10表达，当TLR10基因突变，可导致下游介导炎性因子分泌信号通路改变，T细胞调节功能被抑制，进而导致病毒清除能力降低[18,19]。由此提示，TLR10基因与HBeAg阳性CHB患者免疫应答密切相关，对患者临床转归评估具有重要意义。并且，TLR10基因RS11096957位点基因型中，应答组基因型分布频率无明显差异，而应答组A等位基因频率(61.36%)显著高于非应答组(39.58%)，说明TLR10基因RS11096957位点A等位基因频率突变与应答免疫有关。究其原因，LR10基因单核苷酸多态性与幽门螺杆菌相关性胃炎、支气管哮喘、呼吸道合胞病毒感染等多种疾病有关，其作用机制尚不明确，但其人体免疫调节中具有重要作用，推测其基因表达可能通过影响免疫应答参与HBV发展过程，进而影响患者临床转归[20,21]。TLR10是一种功能性受体，并且是唯一调控TLR2信号通路应答抑制性受体，可经配体刺激后促进TLR2细胞通路下游炎性因子分泌，机体野生基因分布降低，血单个细胞IL-1 受体拮抗剂mRNA和蛋白水平升高，进而发挥抗炎作用，促进免疫应答，提高HBeAg血清转换率，减轻肝组织坏死程度，逆转纤维化[22,23]。因此，TLR10发生变异型突变后可导致RS11096957位点A等位基因频率增加，促进免疫应答发生，导致病毒清除能力降低，提示可对HBeAg阳性CHB患者进行基因检测然后根据基因型和等位基因频率分布情况进行调节治疗，改善基因耐药情况，提高临床治疗效果，改善预后。

另外，对TLR10基因进行Logistics回归分析发现，TLR10基因RS10004195位点中，A型基因，A等位基因频率和RS11096957位点中A等位基因频率是HBeAg阳性CHB患者PEG-IFNα治疗临床转归的独立危险因素(OR>1，P<0.05)，提示TLR10基因RS10004195位点A 型基因携带者和RS11096957位点A等位基因携带者更易发生免疫应答，可通过检测其基因型分布情况，进而为临床治疗提供指导依据。这可能是因为TRL10在多种免疫细胞中表达，可通过与其他TRL协同，在免疫应答中发挥负性调节作用，可通过抑制信号通路中IKB、MAOK、MyDNA88 和TRIF蛋白表达，影响下游炎性因子分泌，进而抑制TLR介导的免疫应答[24,25]。因此，TLR10基因参与HBeAg阳性CHB患者PEG-IFNα治疗后临床归转过程，可为临床治疗及患者预后转归提供重要参考依据。但由于本次研究样本较少，且LR10基因在HBeAg阳性CHB患者PEG-IFNα治疗中对免疫应答的机制尚不完善，其与免疫应答中的直接关系还有待深入，还需扩大样本进一步研究，进而为临床治疗方案的制定提供指导依据。

综上所述，TLR10基因RS10004195位点A型基因，A等位基因频率突变，及RS11096957位点中A等位基因频率是影响HBeAg阳性CHB患者PEG-IFNα治疗后临床归转的独立危险因素，其基因表达与HBeAg阳性CHB患者治疗后免疫应答密切相关，可通过检测其基因表达为临床治疗及预后提供指导依据。