基于miRNA-132信号通路探究胡椒碱对肝癌血管形成及肿瘤抑制作用*

康助习 匡 黎 郭 俊 权瑞泉 魏 英

国药东风总医院肿瘤科 (湖北 十堰，442000)

原发性肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，主要病因是肝细胞及胆管细胞发生癌变，恶性程度及转移率较高[1，2]。原发性肝癌全球发病率正逐年增长，在全球恶性肿瘤的发病率中排名第五，死亡率位居第三[3]。近年来，肝癌的诊断方法、细胞生物学、分子生物学研究的快速发展，临床上对肝癌的发生发展、诊断及治疗有了进一步认识，但肝癌患者的预后仍差，特别是对难以切除或已经远处转移的肝癌的治疗方法和手段有限，预后极差。胡椒碱是一种从胡椒属植物中提取的生物碱，在中国和印度是常用的食品和传统药物[4]。研究表明，胡椒碱具有抗感染、抗氧化、抗惊厥、抗炎、保肝、免疫调节和抗肿瘤等广泛的药理作用[5]。学者通过研究黑色素瘤诱导的肺转移发现，胡椒碱可通过抑制其转移而减少肿瘤的形成，由此可见，胡椒碱对抑制肿瘤的转移有一定的作用[6]。然而有关胡椒碱对肝癌的作用机制研究较少。微小RNA(miR)是一类长度20～24 nt的内源性、非编码的RNA基因产物，可与mRNA的3'非翻译区(3'UTR)相结合而达到抑制其翻译，或通过与mRNA翻译区结合而直接引起mRNA的剪切，从而负调控靶基因[7]。人类miR-132位于第17号染色体上，是众多具有潜在调控肿瘤的miRNA之一[8]。有研究发现，miR-132在肝癌、骨肉瘤、结直肠癌等组织中表达水平明显低于正常组织，同时与恶性肿瘤的转移有密切关系，有望成为抑制恶性肿瘤的新靶点[9]。本研究基于miRNA-132信号通路的基础上，探究胡椒碱对肝癌的血管形成及肿瘤的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 细胞系和细胞培养 人肝癌细胞株HepG2购于中国科学院上海生命科学研究院。将HepG2细胞培养于含10%胎牛血清、1×105U/L的青霉素和链霉素的高糖DMEM培养基中，每48 h换液1次。待细胞融合度达80%时，用0.25%胰蛋白酶消化贴壁细胞，传代培养。细胞传代2～3 d 1次，实验取对数生长的细胞。

1.2 实验动物 BALB/c雄性裸鼠55只，SPF级，4周龄，体质量15～18 g，均购于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证：SCXK(京)2016-0006。将裸鼠全部置于22～26℃、相对湿度40%～60%的环境中，自由摄食饮水，适应性喂养1周后用于实验。本实验遵守实验动物福利与伦理原则，经我院伦理委员会批准。

1.3 试剂与仪器 胡椒碱(中国药品生物制品检定所)；DMEM培养基、青霉素/链霉素(美国Hyclone公司)；miR-132 类似物(锐博生物科技有限公司)；兔抗血管内皮生长因子(VEGF)、E2F3单克隆抗体(美国Epitmics公司)；MTT试剂盒、Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；CO2培养箱(德国Binder公司)；XDS-1B型显微镜(上海光学仪器厂)；TGL16型离心机(长沙英泰仪器有限公司)；流式细胞仪(美国BD公司)。

1.4 模型制备和分组 收集对数生长的HepG2细胞，1 000 r/min离心5 min，用PBS溶液重悬，与Matrigel等体积混合，调整细胞浓度为1×107/ml，皮下注射于45只裸鼠右侧腋下部位，接种量为0.2 ml，5 d后可见裸鼠右上肢腋下观察有黄豆大小肿瘤生成，至肿瘤生长至20～40 mm3时视为造模成功，40只裸鼠成功制备肝癌模型。剩余10只小鼠不接种HepG2细胞，设为空白组。待裸鼠瘤体积生长至100～150 mm3时，将成功制备肝癌模型40只小鼠随机分为模型组(肝癌小鼠模型组)、胡椒碱组(肝癌小鼠模型给予胡椒碱干预组)、miR-132组(肝癌小鼠模型给予miR-132类似物组)、联合组(肝癌小鼠模型给予胡椒碱联合miR-132类似物组)，每组10只。

1.5 给药 胡椒碱组小鼠经腹腔注射50 μmol/L胡椒碱；miR-132组小鼠经腹腔注射200 μl miR-132类似物干预；联合组小鼠经腹腔注射50 μmol/L胡椒碱和200 μl miR-132类似物干预；空白组和模型组小鼠腹腔注射等量的生理盐水干预。1次/d，共14 d。

1.6 观察指标

1.6.1 肿瘤体积测定 从第1次腹腔注射给药开始，每隔1 d用游标尺测量肿瘤的最大长经与短经，2 d 1次，同时计算小鼠体内的肿瘤体积均数，绘制肿瘤的生长曲线。瘤体积=(长×宽2)/2。

1.6.2 抑瘤率测定 于第15天处死各组部分裸鼠，取出裸鼠肿瘤组织，称取其质量，计算肿瘤抑制率。肿瘤抑制率=(1-治疗组肿瘤质量/对照组肿瘤质量)×100%。

1.6.3 肿瘤组织病理学观察 麻醉处死各组部分裸鼠，取出肿瘤组织，固定于4%多聚甲醛溶液中24 h，石蜡包埋组织，用切片机将组织切成厚度为4 μm的薄片，二甲苯脱蜡、乙醇脱水后，用苏木精染色切片3 min，伊红染色1 min。中性树胶将清洗后的切片组织封片。光学显微镜下观察肿瘤组织的病理学变化。

1.6.4 ELISA检测血清VEGF含量 取各组裸鼠眼球血，将血液置于冰浴中1～2 h，于4℃环境4 000 r/min离心10 min，收集上层血清。用ELISA试剂盒检测血清中VEGF含量。

1.6.5 肿瘤组织微血管密度(MVD)检测 MVD检测操作步骤按照试剂使用说明书进行，按照Weidner标准，现将切片在低倍光镜下(×100)确定肿瘤内CD34染色阳性的微血管密集区域，在阳性染色最密集区域，在高倍光镜视野下(×100)选取5个视野进行血管计数，取平均值为切片的MVD值。

1.6.6 蛋白质印迹检测肝组织中miR-132、GP73表达 取各组裸鼠肝组织200 mg，冰上剪碎组织，用裂解液裂解组织成组织悬液，4℃ 12 000 r/min离心10 min，收集上层血清，用BCA法对总蛋白浓度进行测定。将组织置于12% SDS-PAGE上，随后转至PVDF膜上，用5% BSA封闭。加入一级抗体，抗miR-132(1∶1 000)，抗GP73(1∶1 000)，β-actin(1∶1 000)，于4℃条件下孵育1～2 h。加入辣根过氧化物酶标记的二抗，在室温环境下结合1 h。用ECL系统试剂盒观察所有条带。通过Image J软件分析条带密度。

1.6.7 双荧光素酶报告靶基因荧光检测 利用生物信息学软件(TargetScan7.1)，预测miR-132调控高尔基体糖蛋白73(GP73)基因结合序列，设计合成GP73 3'-UTR序列及突变后GP73 3'-UTR序列，将合成的两种目的基因片段分别克隆到pmir GLO荧光素酶报告基因载体，构建GP73 3'-UTR双荧光素酶报告基因载体(pmiR-GLO-wt-survivin)及其突变型载体(pmir GLO-mut-survivin)。

使用LipofectamineTM3000分别将这两种重组载体质粒与miR-132 mimics(miR-132)或miR-132阴性对照(NC)共同转染至HepG2细胞。48 h后对荧光素酶活性进行检测。实验重复5次。

2 结果

2.1 各组裸鼠肿瘤体积比较 给药结束后，模型组裸鼠的瘤体积生长为(151.32±10.16)mm3，和模型组相比，miR-132组(103.67±7.62)mm3、胡椒碱组(98.36±7.15)mm3和联合组(58.45±4.21)mm3裸鼠的瘤体积均显著降低，且联合组瘤体积较胡椒碱组和miR-132组降低更明显(P<0.05)；miR-132组和胡椒碱组裸鼠瘤体积差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 各组裸鼠肿瘤生长抑制率比较 模型组肿瘤生长抑制率为0，miR-132组、胡椒碱组、联合组裸鼠肿瘤生长抑制率分别为(31.1±4.13)%、(33.2±4.25)%与(56.3±5.22)%。和模型组相比，miR-132组、胡椒碱组和联合组裸鼠肿瘤生长抑制率显著增加(P<0.05)；联合组裸鼠的肿瘤生长抑制率明显高于miR-132组和胡椒碱组(P<0.05)。

2.3 各组裸鼠肿瘤病理学比较 空白组为正常的肝组织，可见肝小叶结构完整，轮廓清晰，肝细胞以中央静脉为中心的呈放射状排列，肝小叶肝细胞分界清晰，无肿瘤细胞；模型组可见肿瘤形成，且肿瘤细胞状态良好，数量较多，大小不等，排列紧密规则，核畸形，细胞核深染，核浆比失常；miR-132组、胡椒碱组和联合组肿瘤细胞出现明显的凋亡，核质皱缩，细胞轮廓不规则；联合组肿瘤细胞凋亡显著多于miR-132组和胡椒碱组(图1)。

图1 各组裸鼠肝组织病理学表现 (HE染色，×200)

2.4 各组裸鼠血清中VEGF含量和MVD比较 见表1。

表1 各组裸鼠血清中VEGF含量比较

2.5 各组裸鼠肝组织中miR-132、GP73表达比较 和空白组相比，模型组裸鼠肝组织中miR-132表达显著降低，GP73蛋白表达显著增加(P<0.05)；和模型组相比，miR-132组、胡椒碱组和联合组裸鼠肝组织中miR-132表达均明显增加，GP73蛋白表达均显著降低，且联合组中miR-132和GP73表达变化最大(P<0.05)；miR-132组和胡椒碱组裸鼠肝组织中miR-132HE GP73表达比较均差异无统计学意义(P>0.05)(图2)。

与空白组相比，*P<0.05；与模型组相比，△P<0.05；与胡椒碱组相比，#P<0.05

2.6 双荧光素酶检测报告 结果显示，过表达miR-132可降低GP73活性(P<0.05)，可见GP73是miR-132的靶基因，见表2。

表2 双荧光素酶检测报告

3 讨论

肝癌是我国男性发病率位居第2位的恶性肿瘤，其主要是由肝细胞、肝内胆管细胞引发[10]。当前临床治疗肝癌的方法有手术治疗、放射治疗、化学及靶向、免疫介入治疗等，尽管我国一直致力于对肝癌的研究，并在肝癌的检测和治疗方面取得进展，但由于肝癌发病机制复杂、早期诊断困难、治疗水平限制及肿瘤进展迅速且易转移等，导致患者复发率高、预后差等。现行肝癌化学治疗药物以阿霉素和5-氟尿嘧啶等最为常用，但这些药物的治疗有效率低且无明显延长患者生存期效果，因此寻找和开发新的特异性高、疗效好的抗肿瘤药物成为肝癌治疗的焦点[11]。胡椒碱是生物碱类物质，是胡椒的主要生理活性成分之一。其化学结构属于桂皮酰胺类，已有研究证明这类化合物具有多种药理活性，如镇静、催眠、抗惊厥、骨骼肌松弛和抗抑郁等[12]。在抗肿瘤作用的研究中发现，胡椒碱在体内和体外均有良好的抗肿瘤特性，还可以通过抑制转移生长因子和炎症因子的产生来抑制金属蛋白酶的活性等[13]。目前关于胡椒碱对肝癌肿瘤抑制作用的机制研究较少，因此本研究旨在研究胡椒碱对肝癌血管生成及肿瘤的抑制作用。

本研究通过制备肝癌细胞转移瘤，研究结果显示，胡椒碱可减少瘤重，抑制肝癌裸鼠的肿瘤细胞生长，且肿瘤抑制率和miR-132干预效果相似。肿瘤细胞HE染色显示，模型组裸鼠肿瘤细胞状态明显好于胡椒碱组，胡椒碱组肿瘤细胞状态和miR-132组相似。由此提示，胡椒碱可抑制肝癌肿瘤生长有明显的抑制作用，且miR-132类似物也可抑制肝癌所致的肿瘤生长，效果和胡椒碱相似。吉莉[14]研究证实，胡椒碱对人乳腺癌细胞MCF-7和人肝癌细胞HepG2具有较好的抑制作用。

恶性肿瘤最常见的转移途径包括淋巴转移和血行转移，而血管生成是肿瘤生成和转移的关键因素。VEGF是目前已知作用最强的血管生成因子，又称为血管通透因子，是由肿瘤细胞分泌并特异性作用于血管内皮细胞的一种生长因子[15]。VEGF可以通过与血管内皮细胞表面特异性受体结合从而发挥生物学效应。肿瘤一般通过调节细胞黏附、基质降解和细胞运动发生癌细胞转移，血管生成和其在分子机制上极其相似，也是通过以上过程生成血管，可见肿瘤的血管生成和瘤转移密不可分[16]。在治疗肿瘤时，可通过对血管内皮生长因子的抑制而降低血管的生成，进而抑制肿瘤的转移。MVD代表着肿瘤的结构血管数量，在肿瘤的血管形成评价中起重要作用，常作为新生血管生成程度的金标准。胡椒碱对多种恶性肿瘤细胞如乳腺癌、直肠癌、前列腺癌等均有抗肿瘤活性，而且胡椒碱在4T1细胞乳腺癌模型小鼠和道尔顿淋巴瘤模型小鼠体内可以抑制瘤体的生长，延长模型小鼠的生存期，并提高了药物组的存活期。本研究结果显示，胡椒碱组和miR-132组裸鼠血清中VEGF含量和MVD数量均低于模型组，且miR-132组血清中VEGF含量和MVD数量和胡椒碱组无显著差异，提示胡椒碱在一定程度上具有抗肿瘤血管生长的作用。丁文波等[17]研究证实，双丹胶囊联合5-FU能抑制肝癌小鼠肿瘤的生长，并对肝癌小鼠的免疫器官有一定程度的保护作用，其机制可能与下调VEGF的表达而抑制肿瘤血管生成有关。

miR-132定位于人类染色体17p13，是一类与炎症、血管生长、中枢神经系统相关的miRNA。有研究结果显示，肝癌组织中miR-132表达显著降低，其在肝癌中发挥抑癌基因的作用，过表达miR-132可抑制肝癌细胞增殖与转移[18]。本研究结果显示，肝癌裸鼠中miR-132表达降低，miR-132过表达和胡椒碱均可提高miR-132表达。胡椒碱作为常用的调料已经广泛使用了上百年，其还用于医药、防腐剂和除虫等方面。胡椒碱类的抗痫灵是我国自主知识产权第一个抗癫痫药品。抗痫灵是国际首位以儿童为对象的进行临床观察的药品，充分证明了该药的低毒性和安全性。近年来研究发现，胡椒碱还有预防肿瘤发生发展的特性。GT73在正常肝细胞中呈低表达状态，其在病变的肝细胞尤其是肝癌细胞中表达水平显著升高。近年来，GP73作为一种肝癌血清新标志物引起广泛关注，其敏感度和特异性高于甲胎蛋白。此外，有研究结果显示，肝癌患者血清GP73的升高可能是与肝癌细胞大量合成而分泌到血液中有关[19]。本研究结果显示，miR-132和胡椒碱均可抑制肝癌裸鼠肝组织中GP73表达，提示miR-132与GP73呈显著复相关。双荧光素酶结果显示，过表达miR-132可降低GP73活性，进一步证实了GP73是miR-132调控的直接靶基因。沙敏等[20]研究证实，在肝癌患者血清中发现miR-212/miR-132均呈低表达，且miR-212/miR-132均可对肝细胞中的GP73进行调控，进而抑制肝癌的增长。

综上所述，胡椒碱可通过调控miR-132负向调控GP73抑制肝癌血管形成，同时也能显著抑制肿瘤的生长。