辽宁省香葱灰霉病菌鉴定及生物学特性研究

陈 乐 苗则彦 孙柏欣 赵 杨

（辽宁省农业科学院植物保护研究所，辽宁沈阳 110161）

我国的栽培葱有3 个变种，大葱变种（Allium fistulosumL.var.GigantumMakino）、分葱变种（A.fistulosumL.var.CaespitosumMakino）及楼葱变种（A.fistulosumL.var.ViviparumMakino）（梁艳荣，2008）。分葱又称香葱、细葱、四季葱，为百合科葱属植物，以嫩叶和假茎供食，具有特殊辛香风味，是我国重要的调料蔬菜，更是重要的外销蔬菜和出口脱水特色蔬菜（郭元元 等，2022）。香葱的常见病害有霜霉病（Peronospora schleidenii）、灰霉病（Botrytis cinerea）、紫斑病（Alternaria porri）、锈病（Puccinia porri）、疫病（Phytophthora nicotianae）、炭疽病（Colletotrichum spaethianum）等（高春华 等，2008；张风刚 等，2013；张欣，2015；李聪丽 等，2017；王芳 等，2018；于琳等，2022）。随着栽培技术不断进步，规模化设施香葱反季节生产发展迅速，在春季和秋冬季温室内低温、高湿的环境条件下，灰霉病由露地栽培的次要病害上升为设施栽培的主要病害（李聪丽等，2017）。由灰葡萄孢（B.cinerea）引起的香葱灰霉病主要侵染叶片，发病初期叶片上出现梭形或长拖形灰白色斑点，之后病斑逐渐扩大，形成白色坏死斑，导致葱叶扭曲干枯，潮湿环境下病斑上产生大量的灰色霉层，严重影响香葱的品质和产量。

目前，有文献报道的葡萄孢属有35 种，还有一些未确定种，其中能够引起葱属植物灰霉病的病原菌有8 种：灰葡萄孢（B.cinerea）、葱鳞葡萄孢（B.squamosa）、葱细丝葡萄孢（B.byssoidea）、葱腐葡萄孢（B.aclada）、大葱球形葡萄孢（B.globosa）、中国葱葡萄孢（B.sinoallii）、大蒜盲种葡萄孢（B.porri）和球精葡萄孢（B.sphaerosperma）（Martijn et al.，2005；Zhang et al.，2010a），除灰葡萄孢外，其余种类均具有寄主专化性，仅能侵染葱属植物。葱细丝葡萄孢主要引起洋葱茎腐病，但由于发病部位通常呈现出明显的菌丝，而较少产生菌核和分生孢子，因此由该病菌引起的洋葱茎腐病也称为菌丝型茎腐病（Presly，1985a；Kareem et al.，2020；Steentjes et al.，2021）。我国对香葱灰霉病的病原菌研究较少，有报道我国湖北孝感地区香葱灰霉病的病原菌为灰葡萄孢（李聪丽 等，2017）。

本试验以辽宁省香葱灰霉病为研究对象，采用分子生物学鉴定方法明确病原菌种类，并对其生物学特性进行系统研究，探究其侵染规律，以期为辽宁省香葱灰霉病的科学防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2020 年12 月在辽宁省新民市兴隆堡镇香葱栽培区采集香葱灰霉病病样，密封于信封袋内，带回辽宁省农业科学院植物保护研究所园艺病害研究室进行分离、纯化及保存。

1.2 试验方法

1.2.1 病原菌的分离、纯化及回接鉴定 使用灭菌的接种针挑取香葱茎部黑色小菌核，置于75%乙醇中消毒30 s，之后用无菌水反复冲洗3 次，接种于含有链霉素和青霉素的PDA 平板上，20 ℃恒温培养箱中12 h/12 h 光暗交替培养，3 d 后挑取菌落边缘的菌丝，转接至新的PDA 平板上进行纯化培养，纯化后的病原菌放置在灭菌的20%甘油中，4℃冰箱保存备用。

将新鲜健康的香葱叶片用75%乙醇擦拭消毒，之后用无菌水冲洗3 次，擦干水珠后剪成10 cm 小段，置于铺有湿润滤纸的培养皿（直径20 cm）中，使用灭菌手术刀在叶片中间接种部位制造伤口。取培养3 d 的新鲜菌饼（直径5 mm）接种于伤口部位，以不接菌的PDA 培养基为对照。将培养皿置于20 ℃恒温培养箱中12 h/12 h 光暗交替培养4 d，观察发病情况。对发病叶片再次进行病原菌分离，观察菌落形态。

1.2.2 病原菌的分子生物学鉴定 采用CTAB 法提取真菌基因组DNA。采用50 μL PCR 反应体系（2×TaqPCR MasterMix 25 μL，DNA 模板2 μL，正、反向引物各2 μL，ddH2O 19 μL）扩增ITS、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因（G3PDH）、热激蛋白60 基因（HSP60）和依赖DNA 的RNA 聚合酶Ⅱ亚基基因（RPB2）序列。引物序列及PCR 反应条件参照Staats 等（2005）的方法。扩增产物送至北京诺赛基因组研究中心有限公司测序。

从GenBank 数据库下载葡萄孢属28 个种的G3PDH、HSP60和RPB2基因序列，以核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）为外类群，利用Clustal X1.83 软件进行序列比对，比对后的序列运用PAUP v4.0 软件的最大简约法构建系统发育树，1 000 次Bootstrap 检验计算系统发育树中节点的置信度。

1.2.3 碳源、氮源对病原菌生长的影响试验 以察氏培养基为基础培养基，分别以等质量的葡萄糖、肌醇、山梨醇、果糖、D-木糖、D-麦芽糖、D-半乳糖、乳糖、甘露醇等9 种碳源替换基础培养基中的碳源；分别以等质量的尿素、酵母膏、硝酸钾、蛋白胨、硝酸铵、甘氨酸、氯化铵、牛肉膏、硝酸钠等9 种氮源替换基础培养基中的氮源。使用直径为5 mm 的打孔器打取培养3 d 的菌落最外缘新鲜菌饼，分别接种至不同碳源及不同氮源的察氏培养基平板中央，置于22 ℃、12 h/12 h 光暗交替的恒温培养箱中培养，3 d 后采用十字交叉法测量菌落直径，每个处理3 次重复。以不加碳源或氮源的察氏培养基为对照。

1.2.4 温度对病原菌生长的影响试验 使用直径为5 mm 的打孔器打取培养3 d 的菌落最外缘新鲜菌饼，接种到PDA 平板中央，分别置于5、10、15、20、25、30、35 ℃共7 个温度的恒温培养箱中，12 h/12 h 光暗交替培养，分别在培养3、4 d 后采用十字交叉法测量菌落直径，每个处理4 次重复。

1.2.5 pH对病原菌生长的影响试验 将少量1 mol ·L-1HCl 和1 mol·L-1NaOH 溶液加入到融化的PDA培养基中，采用pH 计（0.01 精度）测定培养基的pH 值，调节PDA 培养基的pH 值分别至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0 共7 个梯度。使用直径为5 mm 的打孔器打取培养3 d 的菌落最外缘新鲜菌饼，分别接种到不同pH 值的PDA 平板中央，置于22 ℃、12 h/12 h 光暗交替的恒温培养箱中培养，4 d 后采用十字交叉法测量菌落直径，每个处理3 次重复。

1.2.6 光照对病原菌生长的影响试验 使用直径为5 mm 的打孔器打取培养3 d 的菌落最外缘新鲜菌饼，接种到PDA 平板中央，置于22 ℃恒温培养箱中，设置24 h 连续光照、24 h 连续黑暗、12 h/12 h 光暗交替等3 个光照培养条件，4 d 后采用十字交叉法测量菌落直径，每个处理4 次重复。

1.3 数据分析

采用Excel 和SPSS 19.0 软件进行作图和差异显著性分析，应用Duncan 氏新复极差法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 香葱灰霉病的病原菌鉴定

从香葱病叶上分离纯化获得灰霉病菌菌株，编号为E-1。将菌株E-1 回接到健康的香葱叶片上，22 ℃保湿培养，3～4 d 后可在伤口处观察到白色羊毛状霉层，病斑以接种点向两侧发展成梭形病斑，呈淡黄色（图1）。采用组织分离法对发病的香葱叶片进行病原菌再分离，分离得到的菌株与接种菌形态相似。依据柯赫氏法则鉴定，菌株E-1 是辽宁省香葱灰霉病的致病菌。

图1 香葱灰霉病田间发病症状（A）及接种发病症状（B）

2.2 香葱灰霉病菌的形态特征及分子生物学鉴定

在PDA 培养基中生长的香葱灰霉病菌，菌落致密呈白色棉絮状，气生菌丝丰富、分布均匀，生长14 d 时无分生孢子及菌核产生（图2）。

图2 香葱灰霉病菌在PDA 培养基上生长形态

利用ITS、G3PDH、HSP60和RPB2基因扩增和测序，在NCBI 进行BLAST 比对分析，菌株E-1 属于葡萄孢属（Botrytis）。从GenBank 数据库下载葡萄孢属28 个种的G3PDH、HSP60和RPB2基因序列，依据基因序列采用最大简约法构建系统发育树。结果表明（图3），菌株E-1 与Botrytis byssoidea的标准菌株聚在一个分支，G3PDH及RPB2基因支持率均为100%，HSP60基因支持率为99.59%，证明E-1 属于葱细丝葡萄孢（B.byssoidea）。

图3 基于G3PDH（A）、HSP60（B）和RPB2（C）序列采用最大简约法构建的系统发育树

2.3 香葱灰霉病菌的生物学特性

2.3.1 碳源、氮源对葱细丝葡萄孢菌丝生长的影响 由表1 可以看出，葱细丝葡萄孢菌丝在9 种碳源中均能生长，其中在以果糖和葡萄糖为碳源的培养基中菌丝生长较快，3 d 后菌落直径分别为34.39 mm 和32.89 mm；D-半乳糖和肌醇次之，3 d 后菌落直径分别为28.45 mm 和25.96 mm；而对D-木糖和乳糖的利用相对较低。在9 种氮源中，蛋白胨、酵母膏和硝酸铵均适宜菌丝生长，3 d 后菌落直径分别为36.76、36.35 mm 和35.63 mm，对氯化铵和硝酸钠的利用相对较低，在以尿素为氮源的培养基上完全不生长。

表1 不同碳源、氮源对葱细丝葡萄孢菌丝生长的影响

2.3.2 温度对葱细丝葡萄孢菌丝生长的影响 由表2 可以看出，葱细丝葡萄孢菌丝在10～30 ℃温度范围内均能生长；最适生长温度为25 ℃，培养3 d和4 d 后菌落直径分别为51.11 mm 和65.95 mm；温度低于20 ℃或高于30 ℃时菌丝生长缓慢，5 ℃和35 ℃时菌丝停止生长。

表2 温度对葱细丝葡萄孢菌丝生长的影响

2.3.3 pH 对葱细丝葡萄孢菌丝生长的影响 由表3可以看出，葱细丝葡萄孢菌丝在pH 范围为5.0～11.0时均能生长。pH ＜7.0 时，随着pH 的升高菌落直径逐渐增大；pH=7.0 时菌丝生长最快，培养4 d后菌落直径为59.09 mm；pH ＞ 7.0 时，随着pH 的升高菌落直径大体呈逐渐减小的趋势，pH=10.0 时菌落直径最小，为32.86 mm。

表3 pH 对葱细丝葡萄孢菌丝生长的影响

2.3.4 光照对葱细丝葡萄孢菌丝生长的影响 由表4 可知，在24 h 连续光照及12 h/12 h 光暗交替条件下菌丝生长较快，培养4 d 后菌落直径分别为48.58 mm 和46.99 mm，24 h 连续黑暗条件下菌丝生长最慢，培养4 d 后菌落直径为31.51 mm。

表4 光照对葱细丝葡萄孢菌丝生长的影响

3 结论与讨论

葡萄孢属（Botrytisspp.）真菌可侵染400 多种植物，其引起的灰霉病是世界范围内广泛分布的重要病害。关于葡萄孢属真菌的分类和鉴定，共经历了3 个阶段，Saccardo 分类系统（Saccardo，1886）、Buchwald 分类系统（Buchwald，1949）及Hennebert 分类系统（Hennebert，1973），目前普遍认可的是Hennebert 分类系统。1973 年Hennebert根据分生孢子及分生孢子梗的形态特征、菌落特征和寄主专化性，将已报道的葡萄孢属真菌归纳为22 种（Hennebert，1973）。随着分子生物学的发展，Nielsen 和Yohalem（2001）在葡萄孢属分类中引入分子生物学技术，为葡萄孢属的分类和鉴定提供了可靠依据。2005 年Staats 等采用分子生物学方法，依据热激蛋白60 基因（HSP60）、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因（G3PDH）及依赖DNA的RNA 聚合酶Ⅱ亚基基因（RPB2）构建系统发育树，证实在基因水平上23 种葡萄孢菌为独立的种，同时将B.aclada和B.allii两个种分开（Staats et al.，2005）。其后陆续发现的葡萄孢属新种均以HSP60、G3PDH、RPB2的单基因或多基因系统发育分析为依据，如中国葱葡萄孢（B.sinoallii）、拟蚕豆葡萄孢（B.fabiopsis）、中国葡萄生葡萄孢（B.sinoviticola）及卡罗来拉葡萄孢（B.caroliniana）（Zhang et al.，2010a，2010b；Li et al.，2012；Zhou et al.，2014）。一般情况下，葡萄孢属真菌的鉴定需要通过分子生物学来验证形态学的鉴定结果。G3PDH、HSP60和RPB2作为葡萄孢属的看家基因，序列都长于800 bp，不仅具有较高的种间变异率，且具有较低的种内变异率（Cai et al.，2009；范璇，2015）。因此，在本试验中也选取了HSP60、G3PDH、RPB2等3 个基因用于辽宁省香葱灰霉病菌的分子生物学鉴定。系统发育分析表明，采集于新民市兴隆堡镇香葱栽培区的灰霉病菌菌株E-1 与Botrytis byssoidea的标准菌株聚在一个分支，且G3PDH、RPB22 个基因支持率均为100%，HSP60基因支持率为99.59%，证明E-1 属于B.byssoidea。

真菌的分类依据形态学，包括菌丝、菌核、分生孢子等形态特征。B.byssoidea分生孢子长12～15 μm，宽6.5～9.0 μm，在PDA 培养基中仅产生白色菌丝，不产生分生孢子和菌核（Chilvers &Du，2006）。Presly（1985b）研究表明，在红霉素琼脂培养基上，将菌株置于15 ℃近紫外光的照射下可产生孢子。而在本试验中，B.byssoidea在PDA 培养基中产生大量白色棉絮状菌丝，无分生孢子及菌核产生。

李聪丽等（2017）将湖北孝感香葱灰霉病病原菌鉴定为灰葡萄孢（B.cinerea），其生物学特性研究结果表明菌丝生长适宜pH 值为5.0～6.0，适宜生长温度为15～25 ℃，温度高于30 ℃菌丝停止生长。本试验将辽宁省香葱灰霉病病原菌鉴定为葱细丝葡萄孢（B.byssoidea），其生物学特性研究结果表明菌丝生长最适pH 值为7.0，最适生长温度为25 ℃，温度≤5 ℃和≥35 ℃时菌丝停止生长。可见B.byssoidea较B.cinerea更耐碱性和高温。生物学特性研究对了解病原菌在田间的发展及采取防控措施具有重要意义，另外还需对其发病规律、药剂筛选、抗病品种等方面进行研究达到综合防治的目的。本试验首次明确了辽宁省香葱灰霉病的病原菌种类及其生物学特性，为辽宁省香葱灰霉病的科学防治奠定了理论基础。