不同针刺方案对卒中后抑郁大鼠神经递质及相关炎性因子的影响

秦彦强， 董浩， 孙迎春， 程先宽， 姚海江

1. 中国康复研究中心北京博爱医院中医治疗中心，北京市 100068；2. 首都医科大学康复医学院，北京市 100068；3.北京按摩医院，北京市 100035

目的 探讨不同针刺方案对卒中后抑郁(PSD)大鼠行为学、神经递质及炎性相关因子的影响。

方法 健康雄性Sprague-Dawley大鼠72只，随机分为正常组、模型组、药物对照组、头针组、腹针组和联合针刺组，每组12只。模型组和各干预组采用Longa线栓法和慢性不可预知性温和应激(CUMS)法复合制备PSD模型。药物对照组予氟西汀灌胃，头针组针刺百会、印堂穴，腹针组针刺中脘、关元穴，联合针刺组针刺百会、印堂、中脘、关元穴，连续治疗21 d。分别于实验0 d (造模前)、7 d (CUMS前)、14 d (治疗前)、35 d (治疗后)进行Longa神经功能缺损评分、体质量、旷场试验、糖水偏好实验。实验35 d采用ELISA法检测血清5-羟色胺(5-HT)、多巴胺(DA)、去甲肾上腺素(NE)、干扰素-γ (INF-γ)、肿瘤坏死因子α (TNF-α)和巨噬细胞移动抑制因子(MIF)浓度。

结果 实验35 d时，药物对照组和联合针刺组神经功能缺损评分明显低于模型组(P ＜ 0.01)，药物对照组、腹针组、联合针刺组体质量明显高于模型组(P ＜ 0.01)，药物对照组、头针组、腹针组、联合针刺组水平跨格数、直立次数和糖水消耗量均高于模型组(P ＜ 0.05)；药物对照组、头针组、腹针组、联合针刺组组间均无显著性差异(P ＞ 0.05)。药物对照组、头针组、腹针组和联合针刺组5-HT、DA、NE明显高于模型组(P ＜ 0.01)，IFN-γ、TNF-α、MIF明显低于模型组(P ＜ 0.01)。联合针刺组5-HT高于头针组和腹针组，IFN-γ、TNF-α、MIF明显低于头针组和腹针组(P ＜ 0.01)，DA、NE明显高于腹针组(P ＜ 0.01)。

结论 头针-腹针联合针刺方案可以改善PSD大鼠行为学症状，调节神经递质，调控炎性因子，效果与氟西汀相似。单纯使用头针或腹针也有较好疗效，可以作为次要选择。

0 引言

脑卒中已经成为全球第二大死因和第三大致残原因[1]。据2019年统计，脑卒中已达到我国居民死亡原因的第3位[2]。卒中后抑郁(post-stroke depression,PSD)是卒中后最常见的神经精神障碍，患病率约30%～50%[3]。PSD的病理生理学机制尚不明确[4]，选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(selective serotonin reuptake inhibitor, SSRI)被认为是首选治疗方法[5]。SSRI有增加脑出血和其他副作用风险[6]。心理治疗、行为疗法、运动疗法等也应用于PSD的康复[7]。

针刺对PSD有良好效果，且不良反应较少[8-10]，但作用机制尚不明确。本研究观察不同针刺方案对PSD模型大鼠行为学指标、神经递质5-羟色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)、多巴胺(dopamine, DA)、去甲肾上腺素(norepinephrine, NE)水平，以及炎性相关因子干扰素-γ (interferon-γ, INF-γ)、肿瘤坏死因子 α (tumor necrosis factor-α, TNF-α)和巨噬细胞移动抑制因子(macrophage migration inhibitory factor, MIF)的影响，探讨针刺对PSD的康复机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康清洁级雄性Sprague-Dawley大鼠72只，体质量(200±20) g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，实验动物许可证号SCXK(京)2016-0006。适应性饲养于湿度40%～70%、室温(24±2) ℃的实验室1周，实验室明暗光照12 h交替。

本研究对动物的处理严格遵守《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.2 主要实验仪器及试剂

3111型CO2培养箱：美国FORMA公司。EXL800型酶标仪：美国BIO-TEK公司。KED-808I型电针仪：常州市武进长城医疗器械有限公司。TNF-α试剂盒(批号 1207180709)、 IFN-γ试 剂 盒 (批 号 1214180732)：RAYBIOTECH公司。5-HT试剂盒(批号20200630)、DA试剂盒(批号20200630)、NE试剂盒(批号20200630)：南京建成科技有限公司。盐酸氟西汀分散片(批号8373A，20 mg/粒)：PATHEON FRANCE公司；礼来苏州制药有限公司分包装。针灸针(直径0.25 mm、长25 mm)：苏州东邦医疗器械有限公司。尼龙栓线(2432-A4)：北京西浓科技有限公司。

1.3 模型制备

从72只大鼠选择12只入正常组，造模成功的60只大鼠随机分为模型组、药物对照组、头针组、腹针组和联合针刺组，每组12只。

1.3.1 大鼠大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型

采用改良Longa线栓法[11]制备MCAO模型。大鼠术前禁食12 h，10%水合氯醛3.5 mL/kg腹腔注射麻醉，仰卧位固定。皮肤消毒，颈正中线右侧0.5 cm切口，长约2 cm，暴露颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉，分离血管及周围神经，注意动作轻柔，不可损伤局部微小血管及神经。4-0号医用非吸收缝合线结扎颈外动脉和颈总动脉近段，于颈总动脉结扎处与分叉处之间放置一打好结的丝线但不收紧。动脉夹夹闭颈内动脉，于颈总动脉剪一小口，插入尼龙栓线，收紧备用丝线，松开动脉夹，调整线栓方向，避免插入翼腭动脉，经颈内动脉送入大脑前动脉。深度距颈总动脉分叉处18 mm左右、插入遇到阻力时，提示线栓到达大脑前动脉起始部，停止插入线栓。结扎备用丝线，剪掉多余丝线及线栓，逐层缝合。保温复苏90 min后，将栓线拔出至出现明显阻力，剪掉露出皮肤外的栓线。动物清醒后左前肢无力，向左侧方爬行，或朝左侧转圈爬行，且无烦躁不安，Longa评分[11]2～3分为造模成功。

1.3.2 PSD模型

MCAO模型成功大鼠采用孤养法结合慢性不可预知温和刺激法(chronic unpredictable mild stimulation,CUMS)制备PSD大鼠模型。

MCAO术后稳定1周。单笼饲养，共28 d，包括7种不同刺激，每天随机选取1种刺激方案，同一刺激方案在7 d内不重复出现。刺激方案包括倾斜鼠笼40° 24 h；垫料上洒水200 mL维持潮湿环境24 h；昼夜颠倒24 h；束缚大鼠2 h；将大鼠放入水平震荡器中，以160 r/min高速震荡30 min；大鼠放入自制的瓶中，漏出尾部，用自制夹夹住尾端3 cm处，持续1 min；禁食禁水24 h。

PSD模型成功标志：大鼠精神萎靡、各种活动减少、体质量减轻、食量减少、拱背等，规定时间内水平活动和垂直活动次数明显减少，蔗糖水消耗量降低[12]。

1.4 干预方法

正常组、模型组不作任何干预。其他各组于UCMS开始7 d后给予干预，至UCMS结束。

药物对照组每天予盐酸氟西汀2.31 mg/kg灌胃。药物溶于蒸馏水中，混匀，稍加热，浓度约0.31 g/L。

头针组参照《实验针灸学》[13]取百会、印堂。百会位于顶骨正中，向前斜刺2 mm；印堂位于两眼眶上缘最高点连线中点，向下平刺5 mm。针柄接电针仪，连续波，频率2 Hz，电流强度以大鼠两耳微微震动、无明显烦躁为宜。每天30 min，连续治疗21 d。

腹针组取中脘、关元。中脘位于脐上约20 mm，直刺2 mm；关元位于脐下约25 mm，直刺2 mm。电针方案同头针组。

联合针刺组同时选取百会、印堂、中脘、关元。电针方案同头针组。

1.5 观察指标

1.5.1 神经功能缺损评分

分别于造模前(0 d)、CUMS前(7 d)、治疗前(14 d)、治疗后取材前(35 d)行Longa神经功能缺损评分[11]。0分，无任何神经功能损伤症状；1分，提拎尾部使大鼠身体离开地面，前爪不完全伸展；2分，大鼠行走时，左前肢肌力减弱，身体向左侧旋转；3分，大鼠行走时，左前肢肌力减弱加重，身体向左侧倾倒或无法行走；4分，大鼠意识丧失或昏迷，不能自发行走。

1.5.2 体质量

1.5.3 旷场实验

分别于实验0 d、7 d、14 d、35 d进行旷场实验。100×100×50 cm木质敞箱，底面和四周均为黑色，无盖，底面划分为16个25×25 cm的小方格。大鼠置于敞箱中心，观察3 min内活动情况，以穿越地面方块数作为水平运动得分，后肢直立次数作为垂直运动得分。

1.5.4 糖水试验

分别于实验0 d、7 d、14 d、35 d行糖水消耗试验。大鼠禁食水8 h后，予蒸馏水和2%蔗糖水各1瓶，约500 mL，24 h后调换水的位置并对2瓶水称重。

1.5.5 组织取材与指标检测

行为学指标检测结束后，每组随机选取6只，1%戊巴比妥钠4 mL/kg腹腔注射麻醉，取腹主动脉血5 mL装瓶备用并标记。动脉血静置2 h，冷冻离心机4 ℃、3000 r/min、半径10 cm离心15 min，取上清液-80 ℃冰箱保存。

ELISA试剂盒检测大鼠血清5-HT、DA、NE、INF-γ、TNF-α和MIF含量。按说明书操作，37 °C避光温育10～15 min后，加入终止液终止反应，10 min内在450 nm测量各孔光密度值，绘制标准曲线，查出其浓度。

小学数学教学情境的创设，要符合不同年龄段儿童的心理特点和认知规律，要根据不同的教学内容有所变化。多年来，通过参加课题研究和教学实践，从在新课引入时、在新知的探究中、在知识巩固上、在整个课堂教学中创设不同的情境，我探索了一些方法，并取得了一些收获：

1.6 统计学分析

应用SPSS 25.0软件对实验数据进行分析。计量资料以(±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，符合正态分布数据两两比较采用LSD检验，不符合正态分布数据两两比较采用Dunnett's T3检验。显著性水平α = 0.05。

2 结果

2.1 神经功能缺损评分

实验7 d时，除正常组外，各组评分均为2分，MCAO模型制备成功。14 d时，除正常组外，各组仍为2分，不进行统计分析。35 d时，药物对照组与联合针刺组评分较模型组明显降低(P ＜ 0.01)。见图1。

2.2 体质量

实验0 d时，各组体质量无显著性差异(P ＞ 0.05)。实验7 d、14 d、35 d时，模型组、药物对照组、头针组、腹针组、联合针刺组体质量均明显低于正常组(P ＜ 0.01)。实验35 d时，药物对照组、腹针组、联合针刺组体质量较模型组明显升高(P ＜ 0.01)，4个干预组大鼠体质量无显著性差异(P ＞ 0.05)。见图1。

2.3 旷场实验

实验0 d时，各组水平跨格数与直立次数无显著性差异(P ＞ 0.05)。7 d、14 d、35 d时，模型组、药物对照组、头针组、腹针组、联合针刺组大鼠水平跨格数和直立次数均明显低于正常组(P ＜ 0.01)。35 d时，药物对照组、头针组、腹针组、联合针刺组大鼠水平跨格数和直立次数均明显高于模型组(P ＜ 0.01)；4个干预组之间无显著性差异(P ＞ 0.05)。见图1。

2.4 糖水试验

实验0 d时，各组糖水消耗量无显著性差异(P ＞0.05)。7 d、14 d、35 d时，模型组、药物对照组、头针组、腹针组、联合针刺组糖水消耗量明显低于正常组(P ＜ 0.01)。35 d时，药物对照组、头针组、联合针刺组大鼠糖水消耗量均高于模型组(P ＜ 0.05)；4个干预组之间无显著性差异(P ＞ 0.05)。见图1。

图1 各组神经功能评分、体质量、旷场试验和糖水试验比较

2.5 5-HT、DA、NE

模型组、药物对照组、头针组、腹针组、联合针刺组血清5-HT、DA、NE水平均明显低于正常组(P ＜0.01)。35 d时，药物对照组、头针组、腹针组和联合针刺组5-HT、DA、NE水平均明显高于模型组(P ＜ 0.01)。

联合针刺组5-HT水平与药物对照组无显著性差异(P ＞ 0.05)，头针组和腹针组5-HT水平明显低于联合针刺组(P ＜ 0.01)。

头针组与联合针刺组大鼠DA水平与药物对照组无显著性差异(P ＞ 0.05)，腹针组DA水平明显低于联合针刺组(P ＜ 0.01)。

3个针刺治疗组NE水平明显低于药物对照组(P ＜0.01)，联合针刺组NE水平明显高于腹针组(P ＜ 0.01)。

见表1。

表1 各组5-HT、DA、NE比较 单位：pg/mL

2.6 炎性相关因子

模型组、药物对照组、头针组、腹针组、联合针刺组血清IFN-γ、TNF-α、MIF水平均明显高于正常组(P ＜ 0.01)；药物对照组、头针组、腹针组和联合针刺组IFN-γ、TNF-α、MIF水平均明显低于模型组(P ＜ 0.01)。

头针组、腹针组和联合针刺组IFN-γ水平均与药物对照组相当(P ＞ 0.05)，联合针刺组明显优于头针组和腹针组(P ＜ 0.01)。

联合针刺组与药物对照组TNF-α和MIF水平相当(P ＞ 0.05)，联合针刺组优于头针组和腹针组(P ＜ 0.05)。

见表2。

表2 各组IFN-γ、TNF-α、MIF比较 单位：pg/mL

3 讨论

PSD不仅严重影响患者康复进程和生活质量[15]，更严重影响工作能力。脑卒中后重返工作岗位的比率在不同国家为7%～75%，脑卒中后1年内的中位数约为53%[16]。较低的返岗率会严重影响患者的幸福感和生活满意度[17-18]，加重抑郁情绪。寻求有效安全、患者接受度高的PSD康复方案，成为临床主要任务。

中医康复可安全有效改善PSD[19]。由于医学的发展，严重脑损伤后开颅手术的介入，致使针刺治疗在头部取穴时受到影响。

我们尝试开发一种在头针应用受限时的替代治疗方案。因此本研究分别使用头针(百会、印堂)、腹针(中脘、关元)治疗和头腹针(百会、印堂、中脘、关元)联合的方案，评价各方案对PSD大鼠行为学、单胺类递质及炎性相关因子的影响。

通过预实验及文献研究[20-21]发现，缺血性脑卒中后进行孤养并给予CUMS，有利于获得更可靠的PSD模型。目前，SSRI是国内外公认的用于治疗PSD的临床一线药物。盐酸氟西汀能够选择性抑制5-HT转运体，阻断突触前膜对5-HT的再摄取，使体内5-HT保持较高含量，延长和增加5-HT的作用，从而产生抗抑郁作用，常用于抗抑郁研究[22]。本研究应用盐酸氟西汀作为疗效对照，分析不同治疗方案对PSD大鼠血清5-HT、DA、NE的影响，观察不同治疗方案对PSD的疗效。研究发现，治疗后，4种治疗方法均对PSD模型大鼠有效；各治疗组之间疗效无显著性差异，提示头针、腹针或联合应用头、腹针，均有类似药物治疗的作用，与既往研究结果相似[23-25]。

与PSD密切相关的神经递质主要以单胺类神经递质为主[26]。5-HT、DA、NE等可反映单胺类神经递质的活性；5-HT、DA、NE缺乏可导致5-HT受体功能受限，神经递质功能受损，引起抑郁症状[27]。本研究显示，给予药物、头针、腹针和联合针刺治疗均可以提高大鼠血清中5-HT、DA、NE的水平，联合针刺组5-HT水平与药物对照组相当，头针组和联合针刺组DA水平与药物对照组相当。

脑卒中可激活炎性应答系统，引起炎性细胞因子异常，在神经递质合成代谢及免疫调节方面发挥重要作用[28]。在PSD发病机制中，Th细胞因子分泌失衡占有重要地位。IFN-γ属Th1型细胞因子，其异常表达与PSD的发生、发展有关[29-30]。针刺可以纠正PSD患者炎性因子水平紊乱，降低PSD患者血清中IFN-γ水平，调节神经功能[31]。本研究发现，4种治疗均可以降低IFN-γ水平，且头针、腹针或者联合针刺治疗对IFN-γ的影响均与药物治疗相当；联合针刺组优于头针组和腹针组。

TNF-α、IL-1β和其他细胞因子可诱导5-HT转运体和NE转运体的过度表达，导致抑郁样行为[32]。PSD患者血清中TNF-α水平较高[33]，可作为脑卒中患者是否会发生抑郁的预测指标[34]。本研究显示，PSD大鼠血清中TNF-α水平最高，4种治疗均可以降低TNF-α水平。联合针刺与药物治疗对TNF-α调控作用相当，均优于头针或腹针治疗。

MIF是先天免疫和炎症反应的中心细胞因子，一直被认定为促炎因子[35]。MIF可能通过IFN-γ对多巴胺代谢的影响，导致抑郁样症状的产生；MIF水平升高与未来3个月PSD风险增加相关[36-38]。本研究发现，PSD大鼠血清中MIF水平升高，4种治疗均可以降低MIF水平；联合针刺治疗与药物治疗对MIF水平调控作用相当，均优于单纯头针或单纯腹针治疗。

4 结论

头针结合腹针的联合针刺方案，不论在改善PSD大鼠行为学方面，还是调节神经递质领域，以及在PSD相关炎性因子调控方面，均与药物氟西汀作用相当，可作为改善PSD预后的可靠选择。在头腹针不能同时使用时，仅使用头针或腹针依然具有较好疗效，可以作为次要选择。头针结合腹针的联合针刺方案调控神经递质及炎性因子的机制尚不明确，需要进一步深入研究。

利益冲突声明：所有作者声明不存在利益冲突。