IL-17A 基因-197A/G 位点顺式调控机制及其对IL-17 表达的影响

李继荣，王志坚，陶保菊

（南部战区海军第二医院感染科，海南 三亚 572000）

白介素是一组由多种类型细胞所分泌的、结构和功能各异的可溶性蛋白，这些蛋白主要用于不同细胞间的信息交换，在炎症反应的发生、发展中发挥了不可忽视的作用。IL-17A 家族由6 个同源的细胞因子IL-17A 到IL-17F 组成，分别与相应的受体偶联并引发的炎症产生。IL-17 主要由活化的T helper-17（Th-17）细胞、双阴性（DN）T 细胞、巨噬细胞和中性粒细胞分泌。在已知的6 个成员中，IL-17A和IL-17F 尤为重要，其在炎症细胞的招募、上调趋化因子表达和促进T 细胞向组织迁移中具有关键的生物学作用，直接或间接介导了多种自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎、哮喘、多发性硬化症、肿瘤、牙体牙周病等。目前对IL-17A 基因相关的研究大多聚焦在IL-17A 基因启动子区几个重要的单核苷酸多态性（SNPs）位点，其中IL-17A 基因rs2275913（-197A/G）和IL-17F 基 因rs763780（7488T/C）位点显得尤为重要。但对于IL-17A 基因启动子区这些重要的SNPs 位点的顺式调控机制及其对IL-17 表达的影响报道较少。本研究通过IL-17A基因启动子区-197A/G 位点区域基因信息学检索，通过EMSA 实验观察-197A/G 位点顺式调控作用，对406 名健康献血员全血样本进行-197A/G 位点基因分型并检测其不同基因型个体的IL-17 水平，初步探讨IL-17A 基因-197A/G 位点顺式调控机制及其对IL-17 表达的影响，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集南部战区海军第二医院血液中心2021 年2 月1 日-6 月1 日406 名健康献血员全血样本，其中男206例，女200 例；年龄25～48岁，平均年龄（36.00±7.52）岁。本研究经南部战区海军第二医院伦理委员会授权，并征求受试者知情同意，签署知情同意书。

1.2 仪器与试剂 酶联免疫吸附试剂盒（默沙克）；DNA 抽提试剂盒Wizard GenomicDNA Purification Kit、PCR 试剂盒GoTaq Green Master（Promega）；EMSA Kit、蛋白酶抑制剂（Pierce）；1640 培养液及胎牛血清（Gibco）；电泳迁移率实验中所有生物素标记DNA 探针及冷竞争探针（Beyotime Biotechnology）；TaqMan 探针试剂盒（Life Technologies Corporation）。

1.3 方法

1.3.1 IL-17 基因-197A/G 位点区域的生物信息学分析 为鉴定与其结合的相关核转录因子，登录TFBIND 门户网站（http://tfbind.hgc.jp/），在线对IL-17 基因-197 位点A/G 等位探针序列进行同源性分析检索，筛选出序列同源性较高的转录因子GATA、CAP。

1.3.2 细胞培养、核蛋白抽提 THP-1 细胞培养基包含RPMI1640、10%胎牛血清、100 U/ml 青霉素-链霉素、2.05 mmol/L 谷氨酰胺。培养箱CO2浓度设定5%，温度37 ℃[1]。核蛋白抽提：收集细胞悬液，4 ℃500×g 离心10 min 去上清，PBS 漂洗后重悬，细胞计数。用1 ml 冷PBS 将细胞重悬于1.5 ml EP管，加入400 μl 冷缓冲液A，振荡混匀。置冰上10 min，振荡10 s，离心后弃上清，加入30 μl 冷缓冲液C，冰孵20 min，离心后收集上清并于-70 ℃保存[2]。

1.3.3 基因组DNA 抽提 取1.5 ml EP 管加入300 μl全血，加入裂解液900 μl 后混匀，室温下孵育10 min。离心弃上清后，重悬白细胞，加核裂解液300 μl，混匀后加蛋白沉淀液100 μl，混匀后离心3 min，转移上清至另一1.5 ml 离心管，加入300 μl 异丙醇，混匀直至出现肉眼可见线状DNA。离心后弃上清，以70%乙醇300 μl 漂洗后离心去乙醇，自然干燥后加入100 μl DNA 水化液，置4 ℃孵箱过夜再水化，2 ℃～8 ℃保存备用[3]。

1.3.4 IL-17A 基因-197A/G 位点多态性测定 应用TaqMan 系统进行基因多态性测定，探针序列（A：VIC -TGCCCTTCCCATTTTCCTTCAGAAG，AGAGATTCTTCTATGACCTCATTGG -MAGBNFQ；G：FAM -TGCCCTTCCCATTTTCCTTCAGAAG，AGAGATTCTTCTATGACCTCATTGG-MAGBNFQ），采用7500 型realtime PCR 仪（ABI）进行抽提DNA 扩增，PCR 扩增反应条件：95 ℃变性处理10 min，92 ℃退火处理1 min，60 ℃延伸1 min，40 个循环[4]。

1.3.5 血清IL-17 水平检测 采集献血员外周静脉血，取2 ml 进行离心处理后获得上清液，采用酶联免疫吸附试剂盒测定IL-17 水平。

1.3.6 EMSA（电泳迁移率检测）实验 采用25 μl 反应体系，将生物素标记双链寡核苷酸探针IL-17A基因-197AA/GG[5'-TTTCCTTCAGAAG（A/G）AGAGATTCTTCTA-3'及互补链] 各1 μl 与THP-1 细胞核蛋白5 μl 室温孵育20 min 上样，以6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳90 min（0.5%TBE,100 V 先预电泳1 h）,湿法转膜1 h（0.5%TBE,380 mA）,将尼龙膜以254 nm 波长紫外光交联10 min，以15 ml Blocking Buffer 封闭15 min，以Stabilized Streptavidin-Horseradish Peroxidase Conjugate 偶联15 min，再用Wash Buffer 漂洗后加入20 ml Substrate Equilibration Buffer 置于定轨摇床上平衡5 min，加入1∶1 Luminol/Enhancer Solution 10 ml 将膜浸泡5 min 后在凝胶成像仪下曝光显影[5]。

1.4 统计学方法 采用SPSS 17.0 统计学软件进行数据分析。计量资料以（）表示，采用t检验；计数资料以[n（%）]表示，采用χ2检验。以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IL-17A-197A/G 位点基因型分布及等位频率不同性别基因型分布及等位频率比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 不同性别基因型分布及频率比较（n，%）

2.2 不同基因型个体血清IL-17 水平比较 不同基因型个体间IL-17 水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05），其中IL-17 水平随基因型由AA[（296.12±63.43）pg/ml] →AG [（262.43 ±56.14）pg/ml] →GG[（159.17±31.46）pg/ml]变化呈递减趋势。2.3 EMSA 实验结果 电泳迁移率检测实验显示，2、5、8、9 泳道可见结合条带，且泳道5 比泳道2 条带强度明显要高，说明未知核因子与-197A 等位探针的亲和力大于-197G 等位。3、4、6、7 泳道进行了-197G、-197A 等位探针的竞争稀释实验，被竞争抑制后未知结合条带消失，提示未知核因子与-197G/A 等位探针结合的特异性。8、9 泳道中尝试以候选因子GATA、CAP 冷探针对A 等位生物素标记DNA探针进行竞争抑制，但未知结合条带未消失，提示该转录因子非GATA 和CAP。

图1 IL-17A -197A/G 位点顺式调控作用EMSA 分析结果

3 讨论

炎症反应是机体抵御异源有害物质时产生的一种保护反应。当机体遭遇病原微生物，过敏原、化学物质刺激或组织损伤时，这种保护反应就会发生，从而导致局部或全身的红、肿、热、痛及功能障碍。一般来说，这些症状对于机体是有益的，而这些不适反应主要来源于炎症局部大量炎症因子的释放以及淋巴细胞的浸润，当异源物质被清除后，这些反应就会慢慢消失。人体是个复杂的生态系统，炎性反应对于维持人体的稳态具有至关重要的作用。除此之外，炎症也可以引起人体免疫系统功能紊乱，当异物入侵，抗原提呈后机体的免疫系统不能正常识别或者反应过激一样可导致自身免疫损伤，引发相应的炎症反应。而持续的炎症反应又会导致诸多代谢性疾病，如肿瘤、风湿关节病肥胖、糖尿病、哮喘以及心血管等疾病，并极大程度增加一些相关疾病的易感性。

IL-17 由Th17 细胞分泌产生，是Th17 细胞主要效应因子[6-8]。IL-17 可以促进T 细胞的激活和刺激上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞产生多种细胞因子，如IL-6、IL-8、粒细胞-巨噬细胞刺激因子（GMCSF）和化学增活素及细胞黏附分子1（cellular adhesion molecule 1，CAM-1），从而导致炎症的产生[9-11]。IL-17 的编码基因位于人染色体6P12，基因全长4252 bp，SNP 位点众多，其中IL-17A 的G-197A（rs2275913）和IL-17F 的7488T/C（rs763780）这两个启动子区的SNP 位点报道较多[12-14]。Liu XK等[15]研究认为，IL-17A 基因的G-197A 位点处于启动子区的核因子活跃区，可调控IL-17 表达。与-197G 等位相比，-197A 等位启动子活性更高。Espinoza JL等[16]研究发现，携带-197A 等位基因型PBMCIL-17 表达量更高。

本研究发现，IL-17A 基因-197A/G 等位探针均能与未知核因子特异性结合产生结合条带，且未知核因子与-197A 等位探针的亲和力大于-197G 等位。竞争稀释后未知结合条带消失，证明了未知核因子与-197G/A 等位的结合具有特异性。本研究尝试以候选因子GATA、CAP 冷探针对-197A 等位生物素标记DNA 探针进行竞争抑制，但未知结合条带未消失，提示该转录因子非GATA 和CAP。为进一步探讨IL-17A 基因G-197A 位点对IL-17 表达的影响，本研究采用酶联免疫吸附试剂盒测定不同基因型个体IL-17 水平，发现携带A 等位基因个体其IL-17 检测水平高于携带G 等位基因个体，IL-17水平随基因型由AA→AG→GG 变化呈递减趋势，提示IL-17A 基因G-197A 位点发挥了重要的顺式调控作用，直接影响IL-17 表达水平。IL-17 过量表达容易导致相关疾病产生。研究表明[17-20]，IL-17 与自身免疫性脑炎、哮喘、类风湿性关节炎、牙周炎、病毒性肝炎、溃疡性结肠炎等自身免疫性疾病明显相关。本研究结果表明，IL-17A 基因197A 等位导致IL-17 表达增加，而IL-17 是Th17 细胞主要效应因子，作为重要的致炎因子导致诸多感染性、自身免疫性疾病的发生[21,22]。

综上所述，IL-17A 基因G-197A/G 位点是一个重要的转录调控位点，通过特异性与一未知核转录因子结合而发挥对IL-17 表达的顺式调控作用。