小麦幼苗活性LTR反转录转座子筛选及其对非生物胁迫的响应

2023-02-27周宾寒王书平方正武胡赞民徐兆师张迎新

作物学报 2023年4期

周宾寒杨竹王书平方正武胡赞民徐兆师张迎新,*

周宾寒1杨竹1王书平1方正武1胡赞民2徐兆师3张迎新1,*

1长江大学农学院 / 主要粮食作物产业化湖北省协同创新中心, 湖北荆州 434025;2中国科学院遗传与发育生物学研究所, 北京 100101;3中国农业科学院作物科学研究所 / 农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程 / 农业部麦类生物学与遗传育种重点实验室, 北京 100081

LTR (长末端重复, long terminal repeat)反转录转座子占小麦基因组的60%以上, 筛选小麦基因组中具有转座活性的LTR反转录转座子, 并分析其在非生物胁迫下的响应, 对研究反转录转座子在小麦抗逆境胁迫中的作用具有重要意义。本研究通过生物信息学分析, 从转座子数据库(TREP database)中筛选出4个具有完整结构的LTR反转录转座子Fatima、Wis、Angela和Babara; 同时利用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)、甲基化特异PCR (methylmion specific PCR, MSP)和转座子展示(transposon display, TD)技术分别分析了它们在盐、ABA、H2O2和干旱等处理的小麦幼苗期(二叶一心)叶和根中的表达水平、甲基化水平和转座活性变化。结果表明, 这4个反转录转座子在正常条件下均存在基础水平的转录, 并且能够响应上述4种胁迫而发生转录水平的变化, 且在相同胁迫条件下表达水平变化趋势一致。Fatima、Angela和Babara在非生物胁迫处理下表达水平的提高与其甲基化水平的降低有关, Wis则相反。反转录转座子LTR序列含有胁迫响应顺式作用元件, 但在非生物胁迫条件下顺式作用元件对这4个反转录转座子的调控作用不显著。与叶相比, 这4个反转录转座子在根中对胁迫的响应程度更高, 且在盐和ABA处理下转座活性更强。本研究将有助于进一步揭示LTR反转录转座子对非生物胁迫的响应规律, 为进一步研究利用反转录转座子进行小麦抗逆育种的遗传改良积累资料。

小麦; 非生物胁迫; LTR反转录转座子; 相对表达水平; 转座

转座子元件(transposable elements, TEs)是真核生物基因组中数量最多、分布最广泛的一类DNA元件, 对推动植物基因组进化和提高植物抵抗环境胁迫能力具有重要的作用[1-5]。小麦(L.)是世界上最重要的粮食作物之一, 转座子元件占其基因组80%以上[5]。发掘小麦基因组中的活性转座子元件, 并研究其对环境胁迫的响应, 有助于进一步解析活性转座子元件在小麦基因组中的重要调控作用, 为利用转座子元件提高小麦抵抗环境胁迫的能力提供理论基础。

长末端重复(long terminal repeat, LTR)反转录转座子是小麦基因组中数量最多的一类转座子元件[6], 其序列由编码序列及编码序列两侧高度相似的LTR序列组成。两侧的LTR序列长度在100到几百万个碱基对之间, 不编码任何蛋白质, 但含有反转录转座子转座所需的启动和终止序列, 对LTR反转录转座子转座的起始具有重要的作用; 编码序列主要包含群特异性抗原(group specific antigen, GAG)和多聚酶(polyprotein, POL),基因编码衣壳样蛋白, 参与LTR反转录转座子的成熟和包装, 使其插入整合到基因组中,基因编码反转录转座子转座所必需的酶和蛋白, 主要包括反转录酶(reverse transcriptase, RT)、核糖核酸酶H (RNaseH)和整合酶INT (Integrase)[7]。根据转座机制和序列结构特点, LTR类转座子又可分为5个亚类: Ty1/copia、Ty3/gypsy、Bel-Pao、Retrovirales和ERV elements。其中Ty1/ copia和Ty3/gypsy是在生物界分布最广, 数量最多的2个超家族, 两者的区别在于INT的位置不同[8], Ty1/copia中POL蛋白的排列顺序为5′-INT-RT- RH-3′, 而Ty3/gypsy为5′-RT-RH-INT-3′[7]。

转座子元件在植物基因组内的转座容易引起基因组重排、基因表达和结构变化等变异, 进而影响基因组的稳定性和基因的正常功能[9], 为减弱转座子转座给基因组造成的危害, 植物基因组内的转座子元件通常受甲基化等表观遗传调控的影响而处于沉默或失活状态[10-11], 尽管如此, 具有潜在转座活性的转座子元件在生物胁迫或非生物胁迫条件下仍可被激活, 并对提高宿主植物的抗性具有重要作用[4,9,12]。如: 燕麦中OARE-1被冠锈菌不亲和小种侵染后高度激活, 在紫外线、茉莉酸和水杨酸等处理下其表达量会受到强烈诱导, 使植物产生防御反应[13]; 硬质小麦中的Ttdla反转录转座子在盐胁迫下通过结合启动子进行转录增加其周围基因的表达来响应环境胁迫[14]; 拟南芥中的ONSEN反转录转座子会在高温胁迫下被激活[15]; 水稻在干旱胁迫下, INDITTO2转座子能将生长素转录调控给邻近的基因, 通过插入到启动子区来缓解干旱压力[16]。近期研究发现, 转座子元件在小麦A、B和D亚基因组中分别占序列的86%、85%和83%, 并以Gypsy和Copia超家族数量最多, 约占小麦基因组的67.5%[17-18], 其中Gypsy超家族中较为丰富的家族包括Sabrina、Fatima、Sumana/Sunmaya和WHAM, Copia超家族中较为丰富的家族为Angela[5]。从这些转座子元件中筛选出具有转座活性的转座子元件, 并分析其在非生物胁迫下的转座规律, 对进一步解析转座子元件在小麦基因组中的调控作用具有重要的指导意义。目前, 有关小麦转座子元件的研究仍集中在转座子元件序列的鉴定和筛选方面, 而其在非生物胁迫方面的研究较少。

因此, 本研究采用生物信息学方法, 从转座子数据库TREP中筛选出了4个具有完整结构的小麦LTR反转录转座子, 并采用荧光定量PCR、甲基化特异性PCR和转座子展示技术分别对LTR反转录转座子在不同非生物胁迫处理下小麦材料中的表达水平、甲基化水平和转座活性进行了分析, 为利用活性转座子元件进行小麦品种的抗逆遗传改良积累资料。

1 材料与方法

1.1 转座子元件的筛选

从转座子数据库TREP (http://botserv2.uzh. ch/kelldata/trep-db/index.html)中下载小麦转座子元件全部序列, 经DNAMAN软件比对分析转座子元件LTR序列, 利用在线软件Softberry (http://www. softberry.com/)对具有完整LTR序列的转座子元件进行编码序列分析, 再通过NCBI数据库对其编码序列进行BLASTP分析, 参数为默认设置。选取具有完整编码序列, 且5′LTR和3′LTR序列一致的LTR反转录转座子进行后续分析。

1.2 材料与处理

以弱春性、综合抗性较好的小麦品种郑麦9023为试验材料, 将其种子经15%次氯酸钠消毒处理5 min, 蒸馏水冲洗3次, 置于无菌培养皿中培养, 待发芽后移入水培盒中, 并置于温度(25±1)℃, 湿度(70±5)%, 12 h光照和黑暗交替的人工气候箱中培养。待植株处于二叶一心时, 分别用0.1 mol L–1NaCl、0.2 mmol L–1ABA、0.1 mmol L–1H2O2及15% PEG进行胁迫处理[19-20]。胁迫处理设置4个持续时间, 分别为6、12、24和48 h, 以相同时间点正常生长条件下的植株为对照, 设置3个重复。4℃分别收集叶和根经液氮速冻后, –80℃保存备用。

1.3 总RNA提取、cDNA合成和实时荧光定量PCR

采用TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit (TaKaRa)分别提取小麦叶和根的总RNA, 采用PrimeScript IV 1st strand cDNA Synthesis Mix反转录试剂盒(TaKaRa)获得cDNA。

利用软件Primer 3和Primer Premier 6设计荧光定量引物, 具体引物序列见表1, 其中为内参基因[21]。在CFX Connect PCR系统(Bio-Rad)上进行qPCR。20 μL PCR反应体系为: 2× Green qPCR MasterMix10 μL, cDNA 2 μL, 10 μmol L–1引物1 μL和ddH2O 7 μL。扩增程序为: 95℃预变性2 min; 95℃变性15 s, 55℃退火30 s, 循环40次。每个处理3个生物学重复, 采用2–ΔΔCT方法[22]计算基因的相对表达量, 并用Prism软件进行作图分析。

1.4 顺式作用元件分析

通过PlantCARE数据库(http://bioinformatics. psb.ugent.be/webtools/plantcare/html)对4个转座子LTR区进行顺式作用元件分析, 筛选出与胁迫相关的顺式作用元件。

1.5 甲基化特异性PCR (Methylation-specific PCR, MSP)

利用MethPrimer (https://www.urogene.org/cgi- bin/methprimer/methprimer.cgi)设计MSP引物(表2), 以重亚硫酸氢盐转化不同处理基因组DNA为模板进行PCR扩增。20 μL PCR反应体系: 2× FastPremix 10 μL, DNA 1 μL, 10 μmol引物1 μL和ddH2O 8 μL。扩增程序为: 94℃预变性5 min; 94℃变性30 s, 56℃退火30 s, 72℃延伸1 min, 循环35次; 最后72℃延伸10 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。经ImagJ软件对电泳条带面积进行灰度值转换, 并利用TBtools软件生成热图分析。

表1 荧光定量引物序列

表2 甲基化分析引物序列

1.6 基因组DNA提取以及转座子展示技术(Transposon Display, TD)

采用改良后的CTAB法[23]提取基因组DNA, 分别将小麦幼苗的叶和根研磨成粉后加入65℃预热的CTAB提取缓冲液, 置于65℃水浴中每隔15 min颠倒混匀重复2次, 待冷却后加入氯仿异戊醇混合液(24∶1)并离心, 上清液加入异丙醇混匀后于–20℃冰箱静置20 min, 沉淀经75%乙醇漂洗2次, 室温干燥后加入适量TE缓冲液溶解DNA, 于4℃保存备用。

利用转座子展示技术[24]分析转座子元件在非生物胁迫处理条件下的活性, 基因组DNA经I酶切及接头复性后, 通过T4连接酶与酶切产物相连接, 连接产物稀释10倍, 再进行预扩增。25 μL预扩增反应体系: 10×buffer 5 μL, dNTP 4 μL, DNA 1 μL, 10 μmol L–1M-0和TE-1引物各1 μL, ddH2O 13 μL。扩增程序为: 94℃预变性5 min; 94℃变性30 s, 56℃退火30 s, 72℃延伸1 min, 循环30次; 最后72℃延伸10 min。根据检测结果, 将预扩增产物稀释后进行选择性扩增。20 μL选择性扩增反应体系: 2× FastPremix 10 μL, DNA 1 μL, 10 μmol L–1M-1和TE-2引物各0.5 μL和ddH2O 8 μL。扩增程序为: 94℃预变性5 min; 94℃变性30 s, 56℃退火30 s, 72℃延伸1 min, 循环35次; 最后72℃延伸10 min。扩增产物经12%聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离检测。接头序列为MAdapter-top: 5′-GACGATGAGTCCTGAG- 3′, MAdapter-bottom: 5′-TACTCAGGACTCAT-3′, 引物序列见表3。

1.7 统计分析

采用Microsoft Excel 2016软件进行数据处理, 利用GraphPad Prism 6.02进行差异性显著分析, 并用Adobe Illustrator 2020作图。统计结果以“平均值±标准差”的形式表示。

表3 转座子展示分析引物序列

2 结果与分析

2.1 小麦LTR反转录转座子筛选

具有完整结构和一致的LTR序列是LTR反转录转座子能够进行转座的前提[25]。本研究通过生物信息学分析, 共筛选得到4个符合条件的小麦LTR反转录转座子序列: Fatima、Wis、Angela和Babara (图1)。其中Fatima属于Ty3/gypsy类, Wis、Angela和Babara均属于Ty1/copia类。这4个反转录转座子的5′LTR和3′LTR均具有极高的同源性, 其中Fatima的LTR序列的长度为475 bp, 5′LTR和3′LTR的同源性为95.58%; Wis的LTR序列的长度为1608 bp, 5′LTR和3′LTR的同源性为96.84%; Angela的LTR序列的长度为1732 bp, 5′LTR和3′LTR的同源性为97.75%; Babara的LTR序列的长度为1672 bp, 5′LTR和3′LTR的同源性为98.68%。进一步对编码序列进行分析, 发现Fatima能够编码其转录所需的蛋白和酶, 但其缺少编码衣壳蛋白所需的GAG序列, 而Wis、Angela和Babara均能编码其转座所需的包括GAG在内的蛋白和酶(图1)。

图1 小麦中4个LTR反转录转座子的结构分析

GAG: 群特异性抗原; AP: 天冬氨酸酶; INT: 整合酶; RT: 反转录酶; RH:核糖核酸酶H。

GAG: group specific antigen; AP:aspartic proteases; INT: integrase; RT: the reverse transcriptase; RH: RNaseH.

2.2 不同胁迫处理下小麦叶和根中转座子元件的表达水平分析

采用qRT-PCR分析了4个转座子在不同非生物胁迫处理下的表达模式。由图2可知, 不同转座子元件在相同组织和非生物胁迫处理条件下均有不同程度的表达, 相同转座子元件在不同组织和非生物胁迫处理条件下表达程度也均有不同。

经差异显著性分析发现, Fatima分别在12 h的H2O2胁迫处理和干旱胁迫处理的叶中极显著上调表达, 在24 h的H2O2胁迫处理和48 h的盐胁迫处理的叶中显著上调表达, 以及在48 h的H2O2胁迫处理下叶和根中极显著上调表达, 分别是对照组的93.70倍(12 h, H2O2胁迫, 叶)、185.85倍(12 h, 干旱胁迫, 叶)、22.22倍(24 h, H2O2胁迫, 叶)、27.32倍(48 h, 盐胁迫, 叶)、364.13倍(48 h, H2O2胁迫, 叶)和173,793.80倍(48 h, H2O2胁迫, 根); 但在ABA胁迫处理的叶和根均与对照组无显著差异(图2-A)。而Wis仅在24 h的盐胁迫处理的叶和48 h的H2O2胁迫处理的根中均极显著上调表达, 分别是对照组的9824.77倍和1,074,992.00倍; 在ABA胁迫和干旱胁迫处理的叶和根均与对照组无显著差异(图2-B)。同时, Angela在H2O2胁迫处理12 h、24 h、48 h的叶和48 h的根中以及在干旱胁迫处理12 h的叶中均呈现极显著上调表达, 分别是对照组的414.13倍(12 h, H2O2胁迫, 叶)、82.23倍(24 h, H2O2胁迫, 叶)、882.48倍(48 h, H2O2胁迫, 叶)、131,046.20倍(48 h, H2O2胁迫, 根)和113.92倍(12 h, 干旱胁迫, 叶); 而在盐胁迫处理和ABA胁迫处理的叶和根均与对照组无显著差异(图2-C)。此外, Babara仅在H2O2胁迫处理12 h和48 h的叶以及24 h和48 h的根中呈现显著或极显著上调表达, 其表达量分别是对照组的179.44倍(12 h, 叶, 极显著)、2274.01 (48 h, 叶, 极显著)、85,246.49倍(24 h, 根, 显著)、487,726.95倍(48 h, 根, 极显著); 而在盐胁迫处理、ABA胁迫处理和干旱胁迫处理的叶和根均与对照组无显著差异(图2-D)。

(图2)

A: Fatima; B: Wis; C: Angela; D: Babara; Mock: 对照。采用Tukey法进行检验, *表示在0.05概率水平差异显著; **表示在0.01概率水平差异显著; ***表示在0.001概率水平差异显著。

A: Fatima; B: Wis; C: Angela; D: Babara; Mock: control. Tukey method is used to test, *, **, and *** indicate significantly different at< 0.05,< 0.01, and< 0.001, respectively.

2.3 转座子顺式作用元件分析

为了进一步解析这4个反转录转座子对上述胁迫的差异性响应是否受其LTR区携带的顺式作用元件影响, 本研究对其LTR序列分别进行了顺式作用元件分析(表4)。含有厌氧反应相关顺式作用元件ARE和光响应相关元件Box4;含有ABA响应相关顺式作用元件ABRE、干旱胁迫响应元件MYC、光响应元件ACE、G-Box和G-box以及厌氧反应相关顺式作用元件ARE;含有ABA响应相关顺式作用元件DRE1和LTRE、干旱响应相关顺式作用元件MYC和LTRE、光响应相关顺式作用元件G-box、厌氧反应相关顺式作用元件GC-motif以及低温响应相关顺式作用元件LTR;含有ABA响应相关顺式作用元件ABRE和DRE1、干旱响应相关顺式作用元件MYC、光响应相关顺式作用元件G-Box、厌氧反应相关顺式作用元件ARE、低温响应相关顺式作用元件LTR以及赤霉素反应相关顺式作用元件TATC-box。

表4 小麦反转录转座子中胁迫应答相关顺式作用元件分析

2.4 不同胁迫处理下转座子元件的甲基化水平分析

LTR反转录转座子的5'LTR序列含有启动反转录转座子转录的序列, 该区域甲基化水平的变化决定了该反转录转座子能否正常转录。为检测胁迫处理条件下反转录转座子的甲基化水平是否受到影响, 本研究通过MSP技术分别对Fatima、Wis、Angela和Babara在LTR序列区的甲基化水平进行了分析(图3)。发现不同转座子元件甲基化水平在相同组织和非生物胁迫处理条件下均有不同程度变化, 同一转座子元件在不同组织和非生物胁迫处理条件下甲基化水平也不同。

Fatima甲基化水平在盐胁迫和干旱胁迫处理6 h的叶中均显著降低, 分别较对照组降低了24.47% (盐胁迫)和34.14% (干旱胁迫); 在H2O2胁迫处理12 h的叶和干旱胁迫处理24 h的根中均显著升高, 分别较对照组增加了24.97% (12 h, H2O2胁迫, 叶)和235.59% (24 h, 干旱胁迫, 根)。

Wis甲基化水平在盐胁迫处理12 h和48 h的根中、ABA胁迫处理48 h的叶和24 h的根中以及干旱胁迫处理48 h的根中均显著升高, 分别是对照组的1.72倍(12 h, 盐胁迫, 根)、3.00倍(48 h, 盐胁迫, 根)、1.30倍(48 h, ABA胁迫, 叶)、2.63倍(24 h, ABA胁迫, 根)和2.28倍(48 h, 干旱胁迫, 根); 而在盐胁迫处理和干旱胁迫处理的叶中及在H2O2胁迫处理的叶和根中均与对照组无显著差异(图3-B)。

Angela甲基化水平在48 h盐胁迫处理和ABA胁迫处理的叶及H2O2胁迫处理的根中均显著降低, 分别较对照组降低了42.99% (盐胁迫, 叶)、38.15% (ABA胁迫, 叶)、36.93% (H2O2胁迫, 根); 在H2O2胁迫处理48 h的叶中和4种胁迫处理24 h的根中则显著升高, 较对照组分别增加了23.45% (48 h, H2O2胁迫, 叶)、110.89% (24 h, 盐胁迫, 根)、160.72% (24 h, ABA胁迫, 根)、181.34% (24 h, H2O2胁迫, 根)和79.31% (24 h, 干旱胁迫, 根); 而在干旱胁迫处理的叶中与对照组无显著差异(图3-C)。

图3 不同非生物胁迫下小麦幼苗叶和根中反转录转座子的甲基化程度比较分析

A: Fatima; B: Wis; C: Angela; D: Babara; m: marker; M: 甲基化条带; U: 去甲基化条带。

A: Fatima; B: Wis; C: Angela; D: Babara; m: marker; M: methylation band; U: demethylation band.

Babara甲基化水平在盐胁迫处理24 h的叶和根中以及干旱胁迫处理的12 h叶和24 h根中均显著升高, 分别是对照组的1.80倍(24 h, 盐胁迫, 叶)、1.64倍(24 h, 盐胁迫, 根)、1.37倍(12 h, 干旱胁迫, 叶)和1.26倍(24 h, 干旱胁迫, 根); 在4种胁迫处理48 h的根中均显著降低, 分别是对照组的0.68倍(盐胁迫)、0.49倍(ABA胁迫)、0.47倍(H2O2胁迫)和0.68倍(干旱胁迫)。而在ABA胁迫处理和H2O2胁迫处理的叶中与对照组无显著差异(图3-D)。

2.5 不同胁迫处理下转座子元件的转座活性分析

为了进一步验证在胁迫处理条件下转座子元件是否发生了转座, 本研究以处理48 h的小麦幼苗叶和根为供试材料, 采用转座子展示技术对这4个反转录子的转座插入位点进行了检测, 发现不同反转录转座子在相同处理条件下转座活性不同, 同一反转录转座子在不同胁迫处理条件下转座活性也有差别。

Fatima在H2O2胁迫处理的叶中存在2个新的转座位点, 在ABA胁迫处理和干旱胁迫处理的根中分别存在3个和1个新的转座位点(图4)。Wis在H2O2胁迫处理的叶中存在3个新的转座位点, 在ABA胁迫处理、盐胁迫处理和干旱胁迫处理的根中分别存在3个、1个和1个新的转座位点(图4)。Angela在H2O2胁迫处理和干旱胁迫处理条件下各有1个新的转座位点, 而在H2O2胁迫处理的根中存在3个新的转座位点(图5)。此外, Babara在ABA胁迫处理和H2O2胁迫处理的叶中分别存在2个和3个新的转座位点, 在盐胁迫处理、ABA胁迫处理、H2O2胁迫处理和干旱胁迫处理的根中分别存在58个、41个、5个、13个新的转座位点(图5)。

3 讨论

LTR反转录转座子是植物基因组中分布最为广泛的一类转座子, 本研究通过生物信息学分析筛选出的4个具有潜在转座活性的LTR反转录转座子元件(Fatima、Wis、Angela和Babara), 且其均具有高度同源的5′LTR和3′LTR序列, 由此说明这4个转座子在小麦基因组进化过程中变异性较小, 插入基因组中的时间较晚, 保留转座活性的可能性大。此外, Wicker等[5]通过全基因分析, 发现Fatima含有5个亚家族, 均无完整的结构。本研究所鉴定的Fatima反转录转座子缺少编码衣壳蛋白的GAG序列, 但其仍具有转座活性, 说明该反转录转座子虽然不具备自主插入到基因组中的能力, 但能够借助同家族其他成员编码的GAG蛋白进行转座。

植物基因组内, 低活性或沉默的LTR反转录转座子可响应生物或非生物胁迫而发生转录水平的变化, 并进行转座[32-33]。在本研究中, 通过转录水平分析发现4个LTR反转录转座子在正常条件存在基础水平的转录, 短时间的胁迫处理会引起其转录水平的变化, 但促进其上调表达作用不显著(图2), 说明在一定的胁迫条件下, 特别是短时间的环境胁迫下, 植物体可通过表观遗传调控体系和其他保护体系使转座子元件维持在可控制的范围, 避免因转座子元件大量转录或转座而造成基因组损伤和不稳定。在本研究中, 与盐胁迫、ABA胁迫和干旱胁迫相比, H2O2胁迫处理材料中4个LTR反转录转座子转录水平均几乎全部高于对照和其他胁迫处理, 研究已表明, H2O2处理可提高细胞内的超氧阴离子自由基的含量, 进而破坏细胞内的氧化还原平衡, 影响细胞内环境的稳定性[34]。因此, 本研究进一步证明了稳定的细胞内环境对抑制转座子元件转座的重要性, 当环境胁迫对植物的影响超过其承受能力, 细胞内环境的稳定性受到影响时, 植物基因组对转座子元件的抑制作用减弱, 转座子元件发生转座的机会增加。此外, 在Wis、Angela和Babara的5'LTR中虽然含有ABA和干旱响应顺式作用元件(表4), 但通过转录水平分析发现含有顺式作用元件的反转录转座子并不能响应其相应的环境胁迫而上调表达(图2), 反而在同一胁迫下, 随着处理时间的延长, 其表达量变化趋势基本一致(图2), 这也进一步印证了反转录转座子在环境胁迫下的转座与其LTR序列中顺式作用元件关系不强。LTR序列中的顺式作用元件对反转录转座子的转座具体有何作用, 以及不同的LTR反转录转座子在同一环境胁迫下的转录是否具有协同性仍有待进一步验证。

DNA甲基化是调控转座子元件转座的主要方式, 甲基化水平的降低可提高转座子元件的转录水平[35], 在本研究中, Fatima、Angela和Babara在表达量显著提高的材料中的甲基化水平均有不同程度的下降(图3), 由此说明在胁迫处理条件下可降低这3条反转录转座子的甲基化水平, 进而促进转座子元件的转录。此外, 与Angela、Babara和Fatima不同, Wis在表达量上显著上调的材料中的甲基化水平反而升高(图3), 这可能与其插入到功能基因附近有关[36-39]。

图4 小麦幼苗叶和根中Fatima和Wis转座活性分析

M: marker; 1, 5: 盐胁迫; 2, 6: ABA胁迫; 3, 7: H2O2胁迫; 4, 8: 干旱胁迫。图中箭头指示新的转座插入位点, AA、AT、TT、CG、GG、AC、AG、CA、CT、GT、TC、TG、TA、CC、GC和GA分别表示扩增引物的最后2个碱基。

M: marker; 1, 5: the salt stress treatment. 2, 6: ABA stress treatment. 3, 7: H2O2stress treatment. 4, 8: the drought stress treatment. The bands labelled by black arrows indicate new transposition sites in wheat genome. AA, AT, TT, CG, GG, AC, AG, CA, CT, GT, TC, TG, TA, CC, GC, and GA represent the last two bases of the amplication primers used in TD, respectively.

图5 小麦幼苗叶和根中Angela和Babara转座活性分析

转座子元件在植物基因组内的转座活性受其结构和转座方式的影响[40]。在这4个LTR反转录转座子中, Fatima转座活性最低, 这可能与其缺少编码衣壳蛋白的GAG序列有关(图1); 而Wis和Angela两条反转录转座子在序列、结构和长度极为相似[41-42], 因此在本研究中转座活性也相近(图4和图5); 尽管Babara在小麦基因组中的拷贝数远低于其他3条反转录转座子[43], 但其转座活性最高, 这说明反转录转座子在非生物胁迫条件下的转座活性不受其在基因组内的拷贝数的影响。此外, 研究表明LTR反转录转座子在插入到基因组新的位置之前, 会将其RNA转化为染色体外环状DNA (extrachromosomal circular DNA, eccDNA)[44-45], 本研究在4种非生物胁迫中, 这4个反转录转座子在盐胁迫和ABA胁迫处理条件下的转座活性最高(图4和图5), 但表达水平分析的结果则表明其对H2O2处理的响应程度最高(图2)。这是否与其在盐胁迫和ABA胁迫处理条件下形成了大量的eccDNA有关, 将有待进一步研究。

4 结论

本研究筛选出4个具有转座活性的LTR反转录转座子Fatima、Wis、Angela和Babara, 且均具有高度一致的5′LTR和3′LTR序列, 在正常条件下均存在基础水平的转录; 而在非生物胁迫条件下4个反转录转座子转录水平的变化趋势一致, LTR序列中的胁迫响应顺式作用元件对其调控作用并不显著, 其中, Fatima、Angela和Babara转录水平的提高与其甲基化程度降低有关, 而Wis则相反; 同时, 4个反转录转座子在非生物胁迫条件下均可产生新的转座位点, 且在根中转座位点多于叶中。

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Screening of active LTR retrotransposons in wheat (L.) seedlings and analysis of their responses to abiotic stresses

ZHOU Bin-Han1, YANG Zhu1, WANG Shu-Ping1, FANG Zheng-Wu1, HU Zan-Min2, XU Zhao-Shi3, and ZHANG Ying-Xin1,*

1College of Agriculture, Yangtze University, Hubei Collaborative Innovation Center for Grain Industry, Jingzhou 434025, Hubei, China;2Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China;3Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences / National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement / Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Triticeae Crops, Ministry of Agriculture, Beijing 100081, China

LTR (long terminal repeat) retrotransposable elements account for more than 60% of rye genome. It is of great significance to screen active LTR retrotransposons from wheat genome and analyze their transposition, the relative expression levels, and methylation levels under abiotic stress in exploring the role of retrotransposable elements in improving wheat anti-stress ability. Four active LTR retrotransposons (Fatima, Wis, Angela, and Babara) with complete structure were selected from the TREP database by bioinformatics analysis. The relative expression levels, methylation dynamics, and transposition activity of the four LTR retrotransposons were then analyzed at seedling stage (two leaves with one heart) leaves and roots of the stress-treated (NaCl, ABA, H2O2,and PEG) wheat seedlings by qRT-PCR, methylation-specific polymerase chain reaction (MSP), and transposon display method. The results suggested that the four retrotransposons had basic transcription activity under normal conditions, which could be changed under stress conditions, and their variation tendency was similar in the same stress conditions. The up-regulation of Fatima, Angela, and Babara was due to their down-regulated methylation levels, while Wis was opposite. The 3′LTR of LTR retrotransposons contained many stress-responsive-elements, but the regulatory effect of which were not obvious under stress treatments. Compared with that in leaves, the four LTR retrotransposons in roots were more sensitive to stresses and had higher transposition activity. This study will help to further reveal the response regularity of LTR retrotransposons under stress conditions and accumulate data for improving of stress resistance breeding wheat by using transposable elements.

wheat (L.); abiotic stress; LTR retrotransposons; the relative expression level; transposition

10.3724/SP.J.1006.2023.21023

本研究由国家重点研发计划项目(2017YFD0100800), 国家转基因生物新品种培育重大专项(2018ZX0800909B), 湖北省重点研发计划项目(2022BBA0035)和湖北省科学技术重大创新专项(2018ABA085)资助。

This study was supported by the National Key Research and Development Programs of China (2017YFD0100800), the National Major Project for Developing New GM Crops (2018ZX0800909B), the Key Research and Development Program of Hubei Province (2022BBA0035), and the Major Project for Special Technology Innovation of Hubei Province (2018ABA085).

张迎新, E-mail: zhangyingxin1985@126.com

E-mail: z18171732900@126.com

2022-03-29;

2022-07-21;

2022-08-22.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20220819.1727.015.html

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