毒性病理学方法与技术在毒理学试验中的应用

胡楚元，詹丽超，朱啸川

（湖南省职业病防治院，湖南长沙 410007）

毒性病理学是研究药物在不同剂量作用下，从组织病理学水平上探究受试动物的病变原因、发病机制、组织形态改变以及由此而引起的结构功能变化的学科[1]。毒性病理学技术和方法不仅应用于药物安全性评价，而且广泛应用于食品（保健食品）、农药、化学品等的安全性评价，食品的功能性评价检验，以及所有利用各种实验动物的科学研究。科学管理和规范化操作是确保毒性病理学方法与技术精准实施的关键。

1 毒性试验染毒方式及注意事项

1.1 染毒方式

①经口灌胃染毒方式，使用大鼠灌胃针灌胃，一次性完成单次受试物的给予，动物每天经口染毒1次；②经皮染毒方式，以不同剂量受试物每日分别涂布实验动物皮肤上；③吸入染毒方式，将受试物制备成特定浓度的气态、气溶胶或颗粒状物混悬态，以动式染毒系统重复染毒等。

1.2 注意事项

（1）染毒操作时应充分考虑动物的利益，善待动物，防止或减少动物的应激、痛苦和伤害，制止针对动物的野蛮行为。

（2）实验人员需岗前培训，持证上岗，操作技术规范。

（3）保障实验动物的福利伦理，成立动物伦理委员会并进行实验动物福利和动物伦理的审核[2]。

2 实验动物的剖检

2.1 解剖要求

应对计划剖检的全部动物进行全面的大体解剖学检查，剖检时应快速、全面、完整、精细。

2.2 解剖注意事项

（1）解剖前项目负责人应召集相关实验人员安排准备工作，确定解剖人员，明确解剖方案。

（2）了解受试物信息，尽可能明确靶器官；核对动物信息，包括项目编号、动物号、动物性别、剂量组、数量等。

（3）准备解剖器械，如剪刀，镊子，止血钳，解剖板等。

（4）准备固定脏器的容器并贴好标签，配制10%中性福尔马林溶液用来固定组织。

（5）准备解剖所需的记录表格及异常脏器照相装置。

（6）解剖前对动物进行体表检查，包括发育状态、营养状况、精神状态、呼吸系统、消化系统、被毛、皮肤等。

（7）准备麻醉用具：根据试验要求，选择合适的安乐死模式，如乙醚麻醉、10%水合氯醛麻醉、CO2安乐死等。

（8）准备采血用具，包括抗凝管、离心管、采血针等并做好标记，并选择合适的采血方式，如腹主动脉采血。

2.3 大鼠系统解剖要求及方法

（1）大鼠系统解剖的一般检查。主要检查动物外观，包括体形、被毛和皮肤、外生殖器及各腔道；按照顺序打开腹腔、盆腔、胸腔和颅腔，观察各脏器在体位置、颜色、质地、有无出血及有无积液、粘连等[3]。

（2）按照试验方案摘取所需的组织和器官，一般来说组织病理学检查包括脑、心脏、主动脉、食道、肺脏、气管、胸腺、胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、直肠、肝脏、脾脏、肾脏、肾上腺、胰脏、甲状腺、甲状旁腺、有代表性的淋巴结、脊髓（颈、胸、腰段）、坐骨神经、胸骨、膀胱，雄性大鼠的睾丸、附睾、前列腺及精囊，雌性大鼠的卵巢、子宫及阴道。

（3）根据试验要求，对相应脏器进行称重，需称重的脏器，其表面的脂肪或筋膜要剔除干净，以免影响脏器重量，导致试验结果不准确；小脏器如肾上腺、垂体等容易丢失，称重后可直接放到预先准备好的包埋盒中。

（4）留取的组织标本应尽可能块的浸放到固定液中，解剖时应注意力度，避免用力过度损伤脏器，影响后期的组织病理学检查结果。

3 病理学技术在毒理学试验中的应用

3.1 病理工作一般流程

3.1.1 预约登记、标本验收

（1）项目负责人填写《病理组织学检查申请表》。

（2）病理检查人员与项目负责人共同核对样本信息，如样本数量、组织类型等。

（3）病理检查人员填写《病理组织学检查登记表》。

3.1.2 取材

按照毒理试验病理组织学取材SOP 进行取材，并及时填写《毒理试验组织标本取材记录表》。组织标本规范化取材举例如下。

3.1.2.1 脾脏

中部横切取一块，厚度约为2.5mm。

图1 病理工作一般流程

图2 脾脏取材位置

3.1.2.2 肝脏

横切中间叶，纵切左叶，各取一块，厚度为2～3mm，长宽度分别为0.5cm×1.0cm。

图3 肝脏取材位置

3.1.2.3 肾脏

组织取材时，应对左右肾分别进行取材，左侧横切，右侧纵切，含乳头部各取一块，取材厚度为2.5mm。

图4 肾脏取材位置

3.1.2.4 心脏

去掉心脏基部血管（横切去除），将切面朝下，沿心脏纵切面最大截面方向取心肌，含左右心房，左右心室，厚度约为2.5mm，大小为0.8cm×0.8cm。

图5 心脏取材位置

3.1.2.5 肺脏

取肺左叶近肺门部组织，横切取一块，大小约为2.5mm×0.5cm×0.8cm。

图6 肺脏取材位置

3.1.3 脱水与包埋

取材后将组织放到脱水盒中(图9、图11)，进行规范化脱水处理及包埋（图7、图8、图10），并及时填写《毒理试验组织标本脱水记录表》 和《毒理试验组织标本包埋记录表》。

图7 樱花全自动脱水机

图8 樱花全自动包埋机

图9 组织取材包埋盒

图11 标本编号

3.1.4 切片与染色

使用（图12）轮转式切片机对已包埋的组织进行切片操作，切片前准备锋利的一次性刀片，将包埋块夹在切片机持块架上，调节角度使其合适，然后转动切片机。使蜡块切面与刀刃平行。切片时，先对蜡块进行粗修使组织平面完全暴露，再进行组织切片。组织切片后需进行1～2h 时烘烤，使组织与载玻片粘贴牢固后方可进行常规HE 染色[4]，使用（图13）樱花自动染色机及自动封片机按预先设定好的程序进行规范化高通量自动染色与封片。上述操作完毕后应及时填写《毒理试验组织标本石蜡切片记录表》 和《毒理试验组织标本染色记录表》。

图12 轮转式切片机

图13 樱花全自动染色机

3.1.5 毒理学试验中的组织病理学检查

3.1.5.1 组织病理学检查原则

（1）先对最高剂量组和对照组的动物标本以及剖检中发现异常的标本进行组织病理学检查。

（2）发现高剂量组动物器官和组织有病变后再对中、低剂量组动物相应器官和组织进行组织病理学检查。

（3）对大体解剖时发现异常的组织脏器进行组织病理学检查；染毒处理组有异常改变的，应对恢复观察期动物相应的器官和组织进行组织病理学检查。

（4）试验过程中死亡或濒死动物，应对全部保留的组织和器官进行组织病理学检查[5]。

3.1.5.2 组织病理学评价流程

镜检前病理学家应该获得的必要信息，包括如下部分：①化学品的特性以及该类物质已知的活性；②该化学品前期的毒性研究结果；③毒理学试验设计的资料；④动物的个体数据（临床症状、体重的变化、食物消耗等）；⑤血液学、临床生化以及尿液分析结果；⑥个体动物的剖检（大体）改变必须提供给病理学家[6]，以上信息对于确定靶器官和认识毒性机制有一定的帮助作用。病理学家还应该了解脏器重量的改变，因为通常组织病理学的改变与脏器重量的改变相关联。

病理学家应该使用标准化的诊断术语和诊断标准，术语应该能够清晰地描述组织病变的特点。如果简单的术语不能很好地描述复杂的病理改变，应使用详细的文字描述对病理结果进行解释。此外，适当地进行同行评议能增加研究中组织病理学改变正确判断的可靠性。

3.1.5.3 组织病理学检查中的数据归档

镜检原始记录，病理报告，病理影像（电子图片或数码照片）原始数据，病理标本（蜡块或玻片）必须归档；同行评议过程中对原病理结果产生改动时需提供一份病理修订报告，也应依据要求进行归档[7]。

4 毒性病理学技术中的生物安全

在毒性病理学试验操作过程中会使用大量的甲醛、二甲苯、酒精、松节油等有害化学物，具有较强的挥发毒性和刺激性，有的甚至具有强致癌性，不仅容易对病理实验人员产生身体伤害，对环境污染也不容小觑。生物安全是实验室安全工作的重点之一，病理实验室应优化实验室空间布局，加大生物安全防护设备的投入力度，设置清洁区，半污染区和污染区[8]。根据实际情况制定病理实验室生物安全制度，建立生物安全意识，避免实验室感染，防止实验室事故发生。实验人员必须进行相关生物安全知识、法规培训，进一步强化职业安全防护意识与防护技能。化学性废物应根据其腐蚀性和毒性分类存放，实验室应统一用废液桶收集，由专业的废液处理公司处置。实验人员要把生物安全防范作为一个长期的工作来做，才能确保毒性病理学试验过程中每个环节的安全，最大程度地避免生物安全事故的发生。

5 小结

毒性病理学试验方法与技术在毒性病理学诊断中具有重要意义，毒性病理诊断的准确性和可靠性对毒理学试验具有非常重要的指导意义，也将影响毒理学试验的发展。随着时代发展和科技进步，毒性病理学规范化平台逐步建设，实验室仪器设备更新换代，毒性病理技术的规范化操作水平不断提高，将为毒理学试验提供充分的保障，在促进我国毒性检测事业蓬勃发展的同时，也将逐渐缩小我国毒性病理学与世界发达国家和地区的差距。