后生素对肠道屏障的影响

2023-02-23周一晨郭贺楠童雨翠斯大勇张日俊

饲料工业 2023年2期

■周一晨郭贺楠张静童雨翠斯大勇张日俊

（中国农业大学饲料生物技术实验室，动物营养学国家重点实验室，北京 100193）

肠道作为动物体内最大的营养性器官，除了在消化和吸收营养物质过程中起到极其重要的作用之外，其屏障功能也在动物生长过程中扮演着不可或缺的角色。在畜禽养殖过程中，当肠道屏障遭受损伤和破坏时，会导致细菌和毒素的移位进而引发肠道内的感染，甚至引发全身性的炎症反应或多器官的衰竭[1]，进而降低其生产性能，甚至导致死亡[2]。过去抗生素是治疗畜禽肠胃屏障损伤疾病的主要手段，抗生素的滥用导致的诸如耐药菌的大量产生、人畜共患病的传播等问题，给消费者带来食品安全隐患。最近，有大量研究发现后生素对改善肠道屏障健康状况有显著作用[3]，有望作为抗生素替代品应用于实际生产。文章将主要介绍肠道屏障和后生素的相关概念以及后生素在肠道屏障方面的积极作用，为新型饲料添加剂的研究提供思路和参考。

1 肠道屏障

肠道屏障可由黏液层、细胞层和固有层及其相关组分构成（见图1）。肠道屏障可按不同组成分为机械屏障、化学屏障、免疫屏障和生物屏障四类，四类肠道屏障通过不同的调控机制、信号通路以及生物学作用之间的有机结合来发挥屏障作用，对抗外源致病菌和有毒有害物质的侵袭[2]。

图1 肠道屏障组成

1.1 机械屏障

机械屏障又可被称为物理屏障，主要由肠黏膜表面的黏液层、肠上皮细胞及其间的连接、黏膜下固有层等组成。黏液层由肠上皮中的杯状细胞分泌的黏蛋白组成，可以通过其疏水性阻止病原菌和毒素进入机体和黏蛋白的流动性将病原菌和有毒有害物质排出体外[4]。肠上皮细胞可以通过其选择性渗透的功能与其间的紧密连接（tight junctions，TJs）、黏附连接和桥粒建立紧密屏障来维护肠道的机械屏障完整性[5-7]。黏膜下固有层是上皮细胞和黏膜肌层之间的一层疏松的结缔组织，由B 细胞、巨噬细胞和嗜酸性粒细胞等免疫细胞组成，主要通过维持肠道内稳态参与肠道屏障功能[8]。

1.2 化学屏障

肠道中的黏液在化学屏障中发挥重要作用，黏液的主要成分是由杯状细胞分泌的黏蛋白[9]。黏蛋白（mucoprotein，Muc）具有的水解抗性和亲水性可以保护上皮免受潜在有害抗原分子的影响[10]。在小肠和结肠内，Muc2 是主要的分泌蛋白[11]。有研究指出，Muc2 基因缺陷的小鼠会缺乏内层黏液层，进而导致许多细菌能够侵入结肠上皮层[12]。除了黏蛋白之外，黏液中所含有的糖蛋白和糖脂也可以结合外来细菌形成复合物后随粪便排出，维持肠道健康[13]。另外，肠腔内由胃肠道分泌的不同种类的消化液以及之中的消化酶、溶菌酶、黏多糖等化学物质和肠道寄生虫产生的抑菌物质也同样是化学屏障的一部分，它们共同组成了抵御微生物和有毒有害物质入侵的一道化学防线[14]。

1.3 免疫屏障

肠道是人体最大的免疫器官，其免疫屏障主要包括免疫细胞及其产生的分泌性免疫球蛋白、免疫因子和肠道相关淋巴组织（gut-associated lymphoid tissue,GALT）。肠道中的派尔集合淋巴结（peyer patch, PPs包含大量的免疫相关细胞[15-16]。免疫因子则主要包括上皮细胞分泌的细胞因子、免疫球蛋白和抗菌肽，它们通过免疫排斥和细菌清除增强屏障功能[17]。GALT又称黏膜免疫系统，它除了可以通过触发局部免疫反应中和抗原物质来抵抗致病因素的侵袭[18]，还可以分泌免疫球蛋白与细菌结合形成复合物随肠道内黏液排出体外，阻碍细菌与上皮受体结合，起到保护肠道的作用[4]。

1.4 生物屏障

肠道中定植着的大量微生物共同组成生物屏障。生物屏障发挥的作用可分为两大方面，一方面是共生肠道细菌或其菌体组成可被肠道内免疫细胞特异性识别，这种作用可以通过建立肠道抗原耐受来维持肠道上皮稳态以及保护黏膜免受损伤[19]。如乳杆菌（Lactobacillus）通过表面的S 层蛋白黏附宿主肠道上皮细胞的表面，竞争性抑制肠道病原微生物的入侵和定植[20]。另一方面共生菌的代谢产物可以调控上述的物理屏障、化学屏障和免疫屏障[21]，抑制有害细菌的定植和生长[22-23]。

2 后生素

后生素包括灭活的微生物及其代谢物和菌体组成成分，其中代谢物包括短链脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）、胞外多糖（exopolysaccharides，EPSs）、细菌素和有机酸等；菌体组成成分则主要有磷壁酸(teichoic-acid)、肽聚糖（peptidoglycan, PG）、衍生多肽、细胞表面蛋白和菌毛型结构等（见图2）[24-27]。代谢产物和菌体组成都是在微生物生长繁殖过程通过生物化学反应产生的化合物，大多数代谢产物会排出至胞外进入环境，因此较容易分离，而菌体组成物质则作为菌体组成成分，往往存在于微生物细胞内或细胞表面，在研究过程中则需要额外对细胞破碎处理和过滤等方式获取，因此相关研究较代谢产物研究也相对较少。下文将选取这两大类物质中的具有代表性的物质，结合前人的研究，就后生素对机体肠道屏障的有益作用及其机制展开叙述。

图2 后生素的组成

2.1 微生物代谢物

2.1.1 胞外多糖

胞外多糖是一类由微生物在生长代谢过程中产生并且分泌到细胞壁外的糖类化合物，其不同的单糖单位组成、糖苷链和支链结构赋予其不同的生物学功能。EPSs 过去在食品工业中被用作稳定剂、乳化剂和水结合剂[28]。

近些年一些关于胞外多糖的营养与免疫学研究发现EPSs表现出的脂质代谢调控[29-30]、抗炎和抗氧化活性[31]，但相关机制还有待深究。此外，近年来也有很多研究发现胞外多糖能够维持肠道屏障的完整性，有效发挥抗炎作用。Wang 等[32]发现从豆腐中分离得到的植物乳杆菌（L. plantarum）产生的EPS 可以显著提高肠黏膜中sIgA以及细胞因子IL-2和TNF-α的分泌量来增强肠道免疫。由德氏乳杆菌（Lactobacillusdelbrueckii）OLL1073R-1 产生的EPS 在猪肠上皮细胞模型中可以调和由poly（I∶C）刺激Toll 样受体（tolllike receptor，TLR）-3后产生的免疫反应，具体表现为增加干扰素（IFN）-α和IFN-β的表达，以及增加抗病毒因子MxA 和核糖核酸酶L（RNase L）的表达，同时也能够减少IL-6和促炎症趋化因子的表达[33]，进而抑制炎症的发生。同样在抑制炎症方面，植物乳杆菌YW11 产生的EPS 在5%葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium salt, DSS）诱导的炎症性肠炎小鼠模型中也具有显著的抗炎效果，炎症相关症状在饲喂低剂量EPS（10 mg/kg）的小鼠中得到了很大的改善，同时饲喂中等剂量EPS（25 mg/kg）可以有效地恢复肠道微生物的多样性，具体表现为罗氏菌属、瘤胃球菌和布劳特氏菌属菌的丰度的增加[34]。在5% DSS 诱导的炎症性肠炎小鼠模型中，植物乳杆菌NCU116的（EPS116）也可以通过促进体内和体外紧密连接蛋白（TJs）的表达，此外，染色质免疫沉淀数据显示，EPS116也可以通过STAT3信号通路与闭锁蛋白和ZO-1的启动子结合进而促进闭锁素和ZO-1蛋白的表达来增强肠道上皮屏障功能[35]。除此之外，阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）Z0206 产生的胞外多糖EPS 和富硒胞外多糖（e-EPS）作为饲料添加剂饲喂断奶仔猪，相较于对照组，可以显著提高断奶仔猪空肠的绒毛高度以及绒毛高度与隐窝深度之比、十二指肠中猪防御素-1（Porcineβ-defensin-1，pBD-1）以及空肠、回肠中猪防御素-2（Porcineβ-defensin-2，pBD-2）的mRNA 相对表达量[36]。Zhao等[37]还发现从植物乳杆菌JY039中分离出的EPS 与副干酪乳杆菌JY062及其复合物，可以改变小鼠肠道微生物群的结构，具体表现为提升双歧杆菌、法氏杆菌的比例，同时通过促进肠道激素YY（Peptide YY，PYY）和胰高糖素样肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）的分泌以及平衡促炎因子IL-6、TNF-α和抗炎因子IL-10 来减少炎症，进而增强肠道屏障功能，抵御外来病原菌的侵袭。综上，胞外多糖可以通过抑制促炎症因子的表达，促进肠道屏障相关蛋白和细胞因子的表达以及维持肠道微生物菌群的稳态来达到对肠道屏障的积极影响。

2.1.2 短链脂肪酸

短链脂肪酸为链长为1～6 个碳原子的饱和脂肪酸，是肠道中膳食纤维以及其他难以消化的碳水化合物经肠道共生菌发酵的主要产物[38]。主要包括乙酸、丙酸和丁酸等，有时也以脂肪酸盐的形式存在。

已有研究表明，肠道发酵产生的短链脂肪酸对机体肠道有许多益处，比如丁酸盐是肠道细胞最重要的能量来源之一，有助于肠道上皮细胞的发育与更新[39]。在肠道炎症方面，丁酸盐也可以增加抑炎细胞因子（IL-10、TGF-β等）的表达以及下调几种促炎症细胞因子和促炎症受体（Caspase-1、NLRP3、IL-1β、IL-25、TLR-2/4等）来诱导机体免疫耐受，进而保护肠道，这一过程主要通过抑制NF-κB1转录因子的活性及其细胞内的途径来实现[39]。除此之外，也有研究指出，猪灌胃SCFAs，与对照组相比，能够增加空肠中Claudin-1、Occludin和十二指肠和回肠中Claudin-1的相对mRNA的表达，仔猪空肠和回肠的绒毛高度显著增加，凋亡细胞比例降低，这些结果表明灌胃SCFAs可以有效增强肠道屏障功能[40]。同样地，Zhang等[41]通过猪盲肠灌注丙酸钠的试验也得出了类似的结论。另一项以感染螺旋毛虫病的小鼠为模型的研究表明，感染的小鼠服用SCFAs溶液有助于减少绒毛-隐窝单元的细胞凋亡，表明SCFAs参与了机体对寄生虫入侵的肠道免疫反应过程[38]。D’Souza等[42]的研究还发现，乙酸、丙酸和丁酸均能够通过增强肠细胞上皮间质电阻（transepithelial electrical resistance，TEER）和降低细胞旁通透性来增强肠道屏障功能。除此以外，在应对由脂多糖诱导的炎症性肠病（IBD）模型中，短链脂肪酸能够抑制相关促炎症因子（IL-1β、TNFα、IL-6）的产生和调节T细胞的增殖来发挥其抗炎特性[42]。此外，也有研究表明在小鼠感染模型中使用高乙酸盐的日粮可以显著提高对肠出血性大肠杆菌O157∶H7感染的抵抗力[43]。

2.1.3 细菌素

细菌素又被称作细菌抗菌肽，是一类具有抑菌活性的蛋白质或多肽，通常由某些细菌通过核糖体合成产生分泌释放到环境中，在过去，细菌素出色的抑菌特性使其在食品保鲜防腐领域扮演重要角色[44]。

近些年来，越来越多的研究发现细菌素在治疗肠道微生物感染和增强肠道屏障功能方面也表现了出色作用，在抗炎和抗感染方面，Yoon 等[45]发现乳酸片球菌产生的细菌素在体外可以有效抑制粪肠球菌对肠道上皮细胞的粘附，同时显著抑制Caco-2 细胞中IL-8的产生，减少炎症的发生。Heeney等[46]的研究得了相似的结论，他们通过将一种植物乳杆菌细菌素应用于暴露于促炎症细胞因子的Caco-2 细胞，可以有效防止细胞大分子渗透性和跨上皮阻力的降低，并减少细胞因子IL-8的产生。另一项研究给肉鸡饲喂由大肠杆菌产生的抗菌肽C7，结果表明，与对照组相比，抗菌肽组Occludin和ZO-1蛋白的基因表达量与sIgA 显著增长，同时降低了机体内促炎症因子TNFα、IL-8、IFN-γ和促炎症受体TLR4 、TLR2 的表达[47]。在肠道微生物屏障方面，对于肠道微生物群落，一种细菌素对多种微生物群落具有微妙且很可能是积极的影响，这对进一步在动物体内开展细菌素如何影响微生物平衡和肠道健康具有重要意义[48]。另一项以日本鹌鹑为研究对象的研究佐证了细菌素对于肠道菌群调控的积极效应，研究人员发现日粮中添加细菌素和有机酸混合物能够显著降低雄性鹌鹑肠道中的大肠杆菌数量，同时显著增加了十二指肠的绒毛高度和减少隐窝深度[49]。同时，郭森等[50]也发现细菌素能显著降低肉仔鸡肠道中大肠杆菌和沙门氏菌数量，提高乳酸杆菌和双歧杆菌数量。从以上研究结果不难看出，细菌素主要通过减少肠道炎症的发生，抵御病原菌的感染和维持肠道菌群稳态来保护肠道屏障，但是相关的机制研究仍有待深入。

2.2 菌体组成

就菌体组成，文章主要讨论菌体细胞壁的结构组成。细菌的细胞壁主要由肽聚糖组成，并以磷壁酸[壁磷壁酸（wall teichoic acid，WTA）或脂磷壁酸（lipteichoic acid，LTA）]、菌毛或鞭毛以及通过不同机制固定在细胞壁上的蛋白质装饰，这些大分子在一定程度上赋予细菌抗原属性并在菌株特异性特征方面发挥关键作用[51]。

过去通常认为菌体组成与感染相关，但是近些年来，不少研究也发现一些菌种的菌体组成结构在胃肠道宿主与微生物相互作用和改善宿主肠道健康方面有着重要的作用[52]。在高龄小鼠的肠炎模型中，从人类体内分离的副干酪乳杆菌D3-5的细胞壁成分中的脂磷壁酸（LTA）可以通过激活TLR2-p38 MAPK信号增强杯状细胞和黏蛋白的产生，并通过抑制NF-κB转录活性和促炎细胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α的表达来减少炎症，从而增强机体肠道屏障，改善和治疗肠炎[53]。相似地，一种植物乳杆菌的脂磷壁酸能显著抑制鳗弧菌在银鲳肠上皮的粘附，除此以外，它还可以通过调节NF-κB、IκB、Bcl2、IL-8 和TNF-α等细胞因子的表达和抑制caspase-9 和caspase-3 的激活来抑制由出血性大肠杆菌诱导的炎症和细胞凋亡相关的通路[54]。对于肽聚糖，研究人员发现，在口服植物乳杆菌细胞壁肽聚糖微球的小鼠盲肠内容物中，乳酸杆菌和双歧杆菌的数量显著增加，而乳酸杆菌和双歧杆菌是肠道中主要的两种益生菌，能对机体肠道屏障产生有益的影响[55]。此外，一种来自鼠李糖乳杆菌MLGA的肽聚糖在不引起肠道炎症的前提下，能够通过上调肠道中β-防御素9 的表达来提高肠道免疫耐受水平，增强肠道面对致病菌侵袭时的免疫屏障[56]。菌体组成在肠道免疫过程中扮演的角色就犹如疫苗在机体免疫中的作用一般，在不引起肠道感染的前提下发挥的抗原作用，从而提高肠道感染耐受。

3 总结与展望

在抗生素替代品的开发与应用的研究道路上，对于肠道感染相关疾病的预防与治疗，其中一部分人将目光转移至益生菌的研究，尽管取得了一定的进展，但是益生菌的应用依然存在着许多问题，比如保存和运输成本高昂，抗逆性较差，微生物易位引发感染[57]等不可控因素过多导致实际应用困难。而灭活的后生素制剂则完美地规避了这些问题。

文章总结了微生物主要代谢产物以及主要菌体组成对肠道屏障相关的研究报道，从相关研究成果不难看出，后生素制剂对于肠道屏障的作用显著（见图3），但同时也暴露了一些亟需解决的问题。比如缺乏作用机制的深入研究；某些种类的后生素缺乏准确定义导致研究开展困难，生产应用难以标准化；某些研究模型科学性不足等。除了上述存在的问题以外，一些研究也能为目前后生素相关研究提供新思路，比如一些来自于革兰氏阳性细菌的细菌素，当它们与包括EDTA[58]、柠檬酸盐[59]、乳铁蛋白[60]在内的螯合剂处理后，可以有效提高其抗菌活性；一些关于肽聚糖的研究也指出，肽聚糖经氧化修饰[61]或者酶解处理后[62]在肠道屏障损伤预防与治疗上能起到更好的作用。