动物园孔雀肠道寄生虫感染情况研究

赵天智，黄建新

大理农林职业技术学院，云南大理 671003

孔雀作为国家一级保护动物，数量稀少且繁殖率不高，在动物保护和观赏方面极具价值，然而孔雀寄生虫病的流行为其带来了驯养难题，寄生虫对宿主的影响一般贯穿于移行和寄生的全部过程中[1]。目前，动物肠道寄生虫病在我国分布范围广、发病率较高，严重影响动物的驯养，许多学者也对动物肠道寄生虫感染情况做过调查[2]。孔雀感染肠道寄生虫在我国各地动物园屡见不鲜，其临床表现缓慢，不易发现，常导致感染肠道寄生虫的群体不断扩大。本试验通过显微镜对孔雀肠道寄生虫卵进行形态学观察，主要从感染寄生虫的种类和感染强度入手，梳理有关学者对寄生虫感染的调查研究，为孔雀肠道寄生虫感染的预防和治疗提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

乙醇；蒸馏水；灭菌玻片；100 mL 量筒；10 mL量筒；冰袋；食盐；载玻片；盖玻片；0.420、0.147 mm的金属筛；烧杯；玻璃棒；自封袋；采集箱；离心管；培养皿，卡红粉，盐酸，滤纸，三角瓶，棕色玻璃瓶、移液管、胶头滴管、10%甲醛溶液、收集管。

1.2 试验器材

低速离心机（上海安亭科学仪器生产厂制造）；光学显微镜（上海通灏光电科技有限公司）；烘箱（苏州铭智电热设备有限公司）；电热炉（锦州远藤电炉科技有限公司）。

1.3 试验方法

1）采集粪样。分不同时段到昆明圆通山动物园采集孔雀的新鲜粪样放入干净的自封袋中（单次粪样）并在自封袋表面做好编号，放入采集箱带回实验室，置于4 ℃的冰箱保存待检。

2）饱和食盐水的配制。将盛有2/3 蒸馏水的500 mL 大烧杯至于电热炉上加热，待烧杯中的水煮沸后，往烧杯中不断加入准备好的食盐，用玻棒匀速搅拌，直至加入大烧杯中的食盐不再溶解为止，关闭电热炉，放置冷却后，保存备用。

3）盐酸卡红染液配制。用小量筒准确量取蒸馏水15 mL，盐酸2 mL，将盐酸加入置于烧杯中的蒸馏水后用电热炉煮沸，趁热加入称取的4 g卡红粉，边加边用玻璃棒搅拌，再加入85%乙醇95 mL，滴加氨水中和待出现沉淀，放置冷却，用滤纸过滤，保存于棕色瓶中备用。

4）孔雀粪便的清洗及离心沉淀纯化。①孔雀粪样的清洗。将圆通山动物园采集的新鲜粪样溶于事先配制的饱和食盐水中，用玻璃棒匀速搅拌，使粪样在饱和食盐水中充分散开，静置一段时间后，将漂浮在饱和食盐水表面的较大杂质去除，肉眼下无明显可见的杂质为止。然后分别用0.420、0.147 mm的金属筛过滤，将过滤液静置20 min，使寄生虫卵漂浮在液体表层。②孔雀粪样的离心沉淀。经过饱和食盐水的漂浮清洗除去了较大的杂质；为进一步纯化孔雀粪样，使寄生虫（卵）富集。将饱和食盐水清洗过的粪液装入离心管中，3 000 r/min 离心30 min，取出离心管，此时离心管中出现分层，寄生虫（卵）富集于离心管底部，杂质漂浮于液面，将离心管中的上层饱和食盐水倒去，重新加入蒸馏水并用玻璃棒将沉积于底部的样本充分散开在水中，制成均一的悬浮液，后扭紧离心管瓶盖再次放入离心机中离心。重复多次离心步骤，直至粪液表面无明显漂浮的杂质，粪液的颜色从浑浊趋向于澄清为止。

5）寄生虫的染色。利用盐酸卡红染色液为寄生虫染色的过程一般包括固定、洗脱、染色、分色4个步骤[3-4]。染色完成后，粪样放置冰箱中4 ℃保存镜检。

6）寄生虫涂片镜检。①稀释：用玻璃棒挑取离心管中少量的粪样，放置于收集管中，加入少许蒸馏水稀释，让粪样在收集管中充分散开，摇动收集管，制成均一的分散体系。②涂片：收集管中的粪样稀释好后，用玻璃棒蘸取液体数滴，放置在干净的载玻片上顺势将其抹匀，涂片时粪样不能太多，涂片完成后载玻片上的粪样保证平整，厚度均匀。③镜检：该过程对操作显微镜技术要求较高，关系能否解决试验的基本任务，严格遵守操作过程。

2 结果与分析

2.1 寄生虫的镜检

在采集的孔雀粪样中，通过饱和食盐水漂浮法、离心沉淀法及盐酸卡红染液的染色，在光学显微镜下看到粪样中存在很多的寄生虫（卵），表明动物园中孔雀感染寄生虫的情况普遍存在。为方便进行形态学观察，将看到的寄生虫（卵）进行数码摄片保存。

2.2 寄生虫的形态学观察

1）毛首线虫卵：虫体呈乳白色。前为食道部，细长，内含有1 串单细胞围绕的食道，后为体部，短粗，内有肠和生殖器官。雄虫后部弯曲，泄殖腔在尾端，有1 根交合刺。雌虫后端钝圆，阴门位于粗细部交界处。

2）蛔虫卵：线虫蛔科属蛔目，虫卵卵壳较厚，处单细胞期，在外界经过3～5 周的成熟过程，为感染性虫卵，属直接发育型。

3）吸虫卵：多成卵圆形或椭圆形，除分体吸虫外都有卵盖，颜色为灰白、淡黄色至棕色，卵在子宫成熟后排出体外，有的排出时仅含卵细胞和卵黄细胞，有的已有毛蚴，有的在子宫内孵化，但大多数需在体外孵化。

4）纤毛虫：滋养体为圆形或椭圆形无色透明或呈淡绿灰色，外被表膜覆盖斜纵行的纤毛。滋养体借助纤毛的行规则的摆动或旋转运动，易变形。在滋养体前端有一凹陷的胞口，下接胞咽，借助胞口纤毛的摆动，将颗粒状食物送入胞咽。

5）单睾丸属绦虫：节片全部宽度大于长度，刃部大而弯曲。生殖孔于单侧，位于节片边缘或亚边缘。睾丸1 个，位于节片中部后缘，卵黄腺块状，吸盘无钩。

6）四棱线虫：无饰带，雌雄异性，雌虫近似球形，长3.5～4.5 mm，宽3 mm，在纵深部位形成深沟，其前端和后端自球体部突出。

7）吸虫尾蚴：由虫体和尾部构成，能在水中活跃运动，体表具棘，有1～2 个吸盘。消化道包括口、咽、食道、肠管；还有排泄器、神经元；为未分化的原始生殖器官。某些尾蚴形成囊蚴或直接经皮肤进入宿主体内，脱去尾部，发育为成虫。

8）异刺线虫：雌雄差异较大，虫体细小，呈毛发状，身体前段有1 个球状角质膨大，口缘有3 个不明显的唇片，有交合刺2 根，不等长。尾细长，生殖孔位于虫体中部稍后方。虫卵壁较厚，内容物一般占据一半的空间。

9）毛圆线虫：该虫体较小，一般不超过7 mm。缺口囊和颈乳突；排泄孔位于靠近体前段的一个明显的腹侧凹迹内；交合刺短而粗，常有扭曲和隆起的脊。

10）膜壳绦虫：成虫长3～8 cm，细似棉线，节片多达500 个，头节纤细易断裂，顶突无钩，睾丸3个，寄生多时达数千条，但致病性不大。

11）绦虫：背腹扁平、带状，白色和淡黄色。虫体大小因种类而异，小的数毫米，大的可达10 m 以上。绦虫由头节、颈节、体节组成，按发育程度分为未成熟节片、成熟节片、孕节片。孕节片子宫极度发达，充满虫卵，其他器官退化。有些绦虫的子宫为盲囊，不向外开口，虫卵不能排出，故必须等待孕节片脱落破裂时才散出虫卵。

12）球虫卵：虫卵囊呈宽卵圆形，壁光滑；有1极粒，孢子囊卵圆形。卵囊含0、1、2、4 或更多的孢子囊，往往根据卵囊数目和每个孢子囊内子孢子数目分属。艾美尔属球虫，每个卵囊有4 个孢子囊。泰泽属球虫，无孢子囊。

3 讨 论

1）在最初试验的过程中，采用的是直接涂片观察的方法。可能因为孔雀采食性和消化系统消化不完全的特征，在显微镜的视野范围内有许多杂质，再加上大部分虫卵透明的特性，严重影响虫卵的辨别。故在试验方法上做了如下改动：①粪便溶液依次通过0.420、0.147 mm 的金属筛，以减少杂质；②不直接涂片观察，增加染色环节。

2）由于寄生虫体型微小，将其直接涂片观察时寄生虫自身颜色与载玻片背景颜色相差不大，不易区分，通过光学显微镜也难辨清其组织结构。为更好地筛选出寄生虫，观察到内部结构形态以便更好地辨别寄生虫的种类，对其进行染色。在经过苏木素染液、抗酸染液、石炭酸复红染液、盐酸卡染液等染色效果对比后，采用盐酸卡红染色，不仅提高了染色效果，而且也得到了比较满意的结果。

3）在最初染色的过程中，没有经过10%甲醛溶液的固定。在其后的染色过程中，不利于卡红的染色，虫体内部结构模糊，在显微镜视野下呈现局部通红；故在加入10%甲醛固定这一环节将寄生虫的内部结构固定，盐酸卡红染色时内部结构着色效果得到改善。

4）为了将寄生虫体内的水分去除，方便染液的颜色能给体内组织更好着色。甲醛固定之后，用乙醇浓度梯度进行寄生虫的脱水，按照低浓度到高浓度进行脱水工作，脱水过程应严格控制时间。脱水时间过长，使寄生虫缺乏弹性与韧性，造成虫体易碎；为改善脱水效果，经过反复试验把每次脱水的时间控制为20 min，逐浓度梯度进行。

5）因每个虫体的脱水效果、与染液的接触等各方面的原因造成虫体内部组织与外表颜色差异较大，一般虫体外表面着色时间长颜色深，内部组织相反；此时用盐酸乙醇进行分色，洗去外表面着色过深的部分，减少内外色差。但分色时间不宜太长，避免洗去过多的颜色，分色时间一般为30 s，之后立即离心，除去上清液。

6）用显微镜镜检时，寄生虫涂片常由于暴露在空气中时间过长造成涂片的干燥，寄生虫缩为一团，犹如细小的微粒看不清内部机构；此时可在涂片上抹上水印，使寄生虫重新舒展开来，方便观察形态，鉴别寄生虫种类。

4 小 结

本次试验主要根据不同寄生虫的形态特征和内部染色结构观察对其种类进行筛选，并对寄生虫的生物学特性进行分析和研究。通过对圆通山孔雀的粪便检察发现孔雀感染了毛首线虫、蛔虫、异刺线虫、毛圆线虫、四棱线虫；球虫、纤毛虫；吸虫；单睾属绦虫、膜壳绦虫等，其中线虫的感染率最高，绦虫感染率次之。在预防寄生虫病时，应遵循无病预防的综合性防治措施，实施科学的、定期的预防性驱虫，驱虫排出的粪便应做严格地处理，孔雀发生病变后应采取隔离治疗，防止病原扩散。