一株假交替单胞菌DL3的抑菌与群体感应淬灭活性研究

赵赛赛，张皓杰，蔡秀磊，王丽荣，申小冉，曹 志，单 虎

(1.青岛农业大学 动物医学院，山东 青岛 266109； 2.山东碧蓝生物科技有限公司，山东 泰安 271411)

随着我国养殖业的迅猛发展，动物养殖中的病害防治问题一直是行业关注的热点及难点。细菌作为主要的动物病原，常引起混合感染或继发感染，严重影响养殖效益[1]。细菌性疾病的防控主要依靠抗生素，而临床上抗生素的不规范使用造成了耐药菌株的增加，且耐药基因在人与动物之间传播，严重威胁着公共卫生安全[2-3]。随着“禁抗令”在我国的全面实施，寻找新的抗生素替代品对于保障养殖健康尤为重要。利用微生物之间的拮抗作用开发新的抗生素替代策略，是目前普遍关注的热点，也是开发细菌性病害的新型绿色可持续防控手段的关键[4-5]。海洋作为巨大的微生物资源宝库，十分具有开发价值，而目前关于海洋微生物及其活性产物在动物养殖中的应用研究甚少。

已有研究表明，许多菌株可以产生抑菌活性物质来抑制病原菌的生长，如放线菌、褐杆菌等。假交替单胞菌也可以产生对弧菌和多种病原菌有明显拮抗作用的抗菌活性物质[6-7]，如抗菌溶菌物质、抗生素、抗真菌物质、胞外多糖以及胞外酶类等，对革兰氏阳性/阴性菌均具有拮抗作用，具有良好的海洋益生菌的发展前景[8]。群体感应(quorum sensing，QS)是微生物之间的一种通信机制，细菌通过感应信号分子浓度的变化来调节细菌群落的基因表达和生理功能，尤其是毒力相关因子的表达[6，9-11]。密度感应淬灭(quorum quenching，QQ)是通过淬灭细菌间的信号分子、干扰致病菌QS系统从而干扰其特定毒力因子表达的手段[12-14]。由于QQ不会给病原菌带来生与死的选择压力，理论上亦不易产生耐药性，故作为病原菌的抗毒力防控手段受到广泛关注[15]。目前已有部分QQ活性菌株被报道，但是研究往往仅限于活性检测，而对于其活性产物在生产中的相关应用研究甚少。因此，进一步挖掘QQ菌株资源，开展其活性产物的研究和开发可以为动物细菌性病害的防治提供新的思路。

本研究从水产养殖池防污附钢片的微生物黏膜中分离到一株假交替单胞菌DL3，根据其16S rRNA序列和系统发育分析进行了初步鉴定，并测定了其对临床分离致病菌的抑菌活性和密度感应淬灭活性，为后期深入开展该菌株及其活性产物的研究和应用奠定了基础，也为海洋微生物资源在动物细菌性病害防控中的应用提供了新思路。

1 材料与方法

1.1 菌株与主要试剂

菌株DL3自青岛某水产养殖池防污附钢片的微生物黏膜中分离而得。经改造具有代表性的报告菌：紫色色杆菌(ChromobacteriumViolaceum)CV026和VIR24，23株临床病原菌(表1)：鳗弧菌(Vibrioanguillarum)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大肠埃希菌(Escherichicoli)、沙门氏菌(Salmonella)、链球菌(Streptococcus)、志贺氏杆菌(Shigella)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、河弧菌(V.fluvialis)、东方弧菌(V.orientalis)、哈维氏弧菌(V.harveyi)和短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)均由青岛农业大学预防兽医实验室保存。

表1 二十三株临床病原菌名称及菌株号

N-酰基高丝氨酸内酯(N-acylhomoserine lactone， AHL)信号分子C6-HSL、3-oxo-C6-HSL、C8-HSL购自美国Cayman Chemical Company， 3-oxo-C8-HSL、C10-HSL、3-oxo-C10-HSL、C12-HSL、3-oxo-C14-HSL购自美国Sigma-Aldrich公司。信号分子均用DMSO溶解并置于-20 ℃保存。

1.2 菌株DL3抑菌谱测定

菌株DL3获取操作同1.1节。参考袁宗胜[16]的方法，将23株指示菌与LB半固体培养基混合(比例1∶100)倒板，在孔中加入菌株DL3菌液50 μL，测定菌株DL3对各指示菌的抑菌活性。同时与氨苄青霉素(10 μg·片-1)、卡那霉素(30 μg·片-1)及四环素(30 μg·片-1)药敏纸片对23株指示菌的抑菌效果进行比较分析。

1.3 菌株DL3的16S rRNA基因测序及序列分析

将纯化培养的DL3菌株转接到2216E液体培养基中，于28 ℃摇床中170 r·min-1条件下振荡培养24 h。提取DL3的全基因组并用16S rRNA通用引物进行PCR扩增，引物序列及扩增体系详见文献[17]。PCR反应程序见文献[18]。经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，确认目的条带大小与理论值相符，送至生工生物工程(上海)服份有限公司测序鉴定。序列结果同韩国标准数据库(www.ezbiocloud.net)进行对比，用序列综合分析软件MEGA5.1以neighbour-joining(NJ)、maximum-likehood(ML)和maximum-parsimony(MP)法构建菌株DL3与相似菌株的16S rRNA基因系统发育树。

1.4 菌株DL3不同培养时间的生物量、抑菌活性检测

将DL3发酵液转接于5 mL的2216E培养基，28 ℃、170 r·min-1条件下分别培养12、24、36、48、60和72 h后，测其D600值，分析菌株DL3在不同培养时间内的生物量变化；DL3发酵液经离心(4 ℃、12 000 r·min-1，10 min)及过滤除菌后，测定D595值，表征胞外产物中的蛋白质浓度[19]，采用牛津杯法分别测定其不同培养时间的胞外产物对V.anguillarumVIB72的抑菌活性强弱。

1.5 菌株DL3的AHL类信号分子降解特性测定

以紫色色杆菌CV026与VIR24为报告菌，参考汤开浩[20]的方法，检测菌株DL3对AHL类信号分子的降解活性。将待测菌液DL3、PIPES缓冲液(1 M)以及C6-HSL或3-oxo-C6-HSL(1 mmol·L-1)按10∶1∶0.1的比例混匀后，于28 ℃孵育过夜，作为待测样品的反应液加入含有报告菌CV026培养液的LB半固体培养基的样品孔中；阳性对照(ddH2O、PIPES缓冲液与各信号分子按比例10∶1∶0.1配制)也按上述条件进行同步孵育、加样，根据紫色晕圈的颜色深浅、有无判断结果。以VIR24为报告菌株测定菌株DL3对C8-HSL、3-oxo-C8-HS、C10-HS、3-oxo-C10-HS、C12-HS、3-oxo-C14-HSL的降解活性，方法同上。

1.6 统计学分析

T-text用于两组之间的比较，使用One-way ANOVA进行多次比较。统计学设定“**”表示差异极显著(P<0.01)，“ns”表示差异不显著(P>0.05)。

2 结果与分析

2.1 菌株DL3的抑菌试验结果

采用牛津杯法对菌株DL3发酵液进行体外拮抗试验，菌株DL3的抑菌试验结果见图1。结果显示， DL3对本实验中选用的23株病原菌均有不同程度的抑制作用，其对V.anguillarum和P.aeruginosa的抑制作用最强，对V.harveyi和V.orientalis抑制作用次之，对V.fluvialis、S.aureus、E.coli、Salmonella、Shigella、Bacilluspumilus、Streptococcus的抑制程度较弱。23株病原菌均为本实验室自临床分离保存的菌株，对氨苄青霉素、卡那霉素及四环素均有不同程度的耐药，而菌株DL3对病原菌的抑制效果显著强于这3种抗生素，提示该菌对临床耐药菌株具有较好的抑菌效果。

图1 菌株DL3对不同指示菌的抑菌活性

2.2 菌株DL3的16S rRNA基因测序与分析

菌株DL3的16S rRNA基因扩增片段大小为1 440 bp，将其序列与韩国标准数据库(www.ezbiocloud.net)对比分析发现，该菌株与解肽假交替单胞菌(P.peptidolytica)NBRC 101021T相似性为99.64%，其次是与金丽假交替单胞菌(P.flavipulchra)CIMB 2033T和杀鱼假交替单胞菌(P.piscicida)JCM 20779T的相似性为99.49%。利用MEGA5.1软件对菌株DL3及相近菌株的16S rRNA基因进行系统发育分析，结果(图2)显示，菌株DL3与P.peptidolyticaNBRC 101021T聚为一簇，亲缘关系最近，初步判断菌株DL3为解肽假交替单胞菌。

“●”表示该节点同ML、MP方法结果一致；“○”表示该节点同ML法结果一致。

2.3 不同培养时间对菌株DL3的生物量、胞外产物蛋白质浓度和抑菌活性的影响

由图3-A可知，菌株DL3的生物量在48、72、96 h极显著高于24 h(P<0.01)，48 h与72 h差异不显著(P>0.05)，48 h和72 h极显著高于96 h(P<0.01)，菌株DL3在培养48 h其生物量达到最高值。由图3-B可知，菌株DL3的胞外产物蛋白质浓度在24 h极显著高于48 h、72 h 和96 h(P<0.01)，48 h与72 h差异不显著(P>0.05)，48 h和72 h极显著高于96 h(P<0.01)。综上，菌株DL3在培养24 h其蛋白质浓度最高。由图3-C可知，菌株DL3在培养24～72 h，对V.anguillarumVIB72抑菌圈直径持续增大，72～96 h呈下降趋势，其对V.anguillarumVIB72抑菌圈直径在24 h为8 mm，48 h为15 mm，72 h为16 mm，96 h为14 mm。由此可见，菌株DL3在培养72 h其抑菌圈直径最大，表明菌株DL3在培养72 h时对V.anguillarumVIB72抑菌活性最强。

A，不同培养时间对菌株DL3生物量的影响；B，不同培养时间对菌株DL3蛋白质浓度的影响；C，不同培养时间对菌株DL3抑菌活性的影响。“**”表示差异极显著(P<0.01)，“ns”表示差异不显著(P>0.05)。

2.4 菌株DL3对AHL类信号分子降解特性的测定

用报告菌CV026检测菌株DL3对C6-HSL和3-oxo-C6-HSL的降解活性，结果(图4)显示，菌株DL3可以完全降解3-oxo-C6-HSL，但对C6-HSL几乎未观察到降解效果。以AHL报告菌VIR24检测长链的AHL类信号分子，结果显示，菌株DL3对C10-HSL、C12-HSL、3-oxo-C14-HSL具有较强降解活性，而对C8-HSL、3-oxo-C8-HSL和3-oxoC10-HSL降解活性略弱。结果提示，菌株DL3对短链、长链信号分子均具有降解活性。

图4 菌株DL3的AHL降解特性测定结果

3 讨论

目前，动物养殖中抗生素的大量使用和不规范使用使得耐药菌株不断增加，动物源耐药菌株的耐药基因可以水平和垂直传播，给动物健康养殖和公共卫生安全带来巨大威胁。随着抗生素耐药菌株的不断增加和对公共卫生的日益重视，迫切需要开发绿色、环保的抗生素替代品[21-22]。益生菌可以通过与病原菌竞争黏附位点减少病原菌在体内的定殖，也可以通过次级代谢产物抑制病原菌生长，具有绿色无残留、安全促生长的优势，受到广泛关注。本实验自水产养殖池防污附钢片的微生物黏膜中分离得到的菌株DL3对选取的23株临床分离病原菌均有抑制作用，抑菌谱较为广泛，对氨苄青霉素、卡那霉素及四环素耐药菌均具有不同程度的抑菌活性，表明菌株DL3具有作为有益菌进行应用的潜力。序列分析结果显示，菌株DL3与解肽假交替单胞菌(P.peptidolytica)NBRC 101021T聚为一簇，均属于假交替单胞菌属。

1995年，Gauthier等[23]采用系统发育分析方法对交替单胞菌属、希瓦氏菌属、弧菌属和假单胞菌属共17个菌株进行序列分析，首次提出了假交替单胞菌属。随着研究的深入，假交替单胞菌属的多种细菌被证明可产生多种次生代谢产物，具有广泛的生物活性，包括抗菌、抗真菌、抗病毒等，具有一定的益生功能。于敏[24]分离到1株金丽假交替单胞菌(P.flavipulchra)JG1，其对弧菌属、芽孢杆菌属等具有较强抑菌活性，自其胞外产物中获得了5种具有抑菌活性的小分子化合物，分别为反式桂皮酸、对羟基苯甲酸、6-溴吲哚-3-乙酸、N-羟基苯并异恶唑酮和2′-脱氧腺苷。Hayashida-Soiza等[25]证明多株假交替单胞菌发酵液的乙酸乙酯萃取物均对临床病原菌具有较强的抑菌活性，如溶藻弧菌ATCC17749、荧光假单胞菌IFO 3903、大肠埃希菌IFO 3366和金黄色葡萄球菌IFO 13276，经鉴定其抑菌物质为异戊酸。

目前，假交替单胞菌被视为研究生物被膜的模式菌株，能够帮助细菌细胞抵抗外界的不利条件，其假交替单胞菌作为有益菌在水产养殖疾病的防控中具有广阔的应用前景。Wang[26]研究表明，在饲料中添加假交替单胞菌，显著提高了凡纳滨对虾在副溶血性弧菌感染下的存活率。王枫林等[27]发现在饲料和水体中添加适宜浓度的杀鱼加交替单胞菌2515，都能够降低对虾肠道内弧菌数量，提高养殖期间对虾的存活率和抗副溶血弧菌感染的能力。Hettiarachchi等[28]首次揭示了解肽假交替单胞菌对枯草杆菌的抑菌活性。此外，除可以产生抑菌活性物质抑制病原菌生长外，有报道称假交替单胞菌的上清液可以抑制铜绿假单胞菌PAO1生物膜的形成，其抗生物膜活性的根本在于抑制了铜绿假单胞菌PAO1的群体感应信号分子乙酰高丝氨酸内酯[29]。

而假交替单胞菌m8和a22[30]中也被证实可以合成L-氨基酸氧化酶，具有QQ活性。QQ技术作为针对菌群间优势竞争的调控手段，更符合生物发展的自然规律，能显著减少耐药菌株的产生[31]。现已从海洋微生物中鉴定出多种具有QQ活性的酶[24]，如芽孢杆菌属、红球菌属、假单胞菌属、青枯菌属、假交替单胞菌等产生的干扰细菌密度感应的酶。本研究分离得到的菌株DL3除具有广泛的抑菌作用外，还对3-oxo-C6-HSL、C10-HSL、C12-HSL、3-oxo-C14-HSL类信号分子具有较强的淬灭活性，推测其代谢产物中既包含抑菌活性物质，又具有密度感应淬灭活性物质。后续我们将进一步探索该菌株对细菌生物膜的形成有无抑制作用，深入挖掘该菌胞外产物中的活性代谢产物并开展其作用机制和应用研究，为动物细菌性病害的防治提供新的靶点。

4 结论

我们分离到一株假交替单胞菌DL3，根据16S rRNA序列鉴定和系统发育分级结果分析，菌株DL3与解肽假交替单胞菌(P.peptidolytica)NBRC 101021T亲缘关系最近。菌株DL3对E.coli、S.aureus、V.fluvialis等7种临床分离的病原菌表现出良好的抑菌活性作用且对病原菌的抑制效果显著强于氨苄青霉素、卡那霉素和四环素。经QQ活性检测发现，菌株DL3对3-oxo-C6-HSL、C10-HSL、C12-HSL、3-oxo-C14-HSL具有较强的淬灭活性，可以以此作为细菌抗毒力治疗的新手段。在今后的研究中，我们将进一步探索和开发假交替单胞菌DL3及其生物活性物质，探讨基于其拮抗作用和群体感应淬灭活性的动物细菌性病害防治的新方案。