淫羊藿-巴戟天治疗新型冠状病毒感染肺肾两虚型的网络药理学分析

张 立，周继红，谢嘉嘉，焦小强，李珏卉，何逸龙

[深圳市宝安中医院(集团)肺病科，广东 深圳 518100]

新型冠状病毒感染(新冠感染)是一种由新型冠状病毒(SARS-CoV-2)引起的急性呼吸道传染疾病。而SARS-CoV-2在传播过程中极易出现突变，例如德尔塔(Delta)、奥密克戎(Omicron)毒株等，其传播力随之增高，除积极研发特效药物及疫苗予以防治外，积极发展中医药特色治疗更有利于患者的治疗与康复。

新冠感染属我国传统医学的“疫病”“瘟疫”之范畴。“疫戾”之气外袭机体，首犯华盖，正邪相争，肺失宣降，乃致出现咳嗽、发热、气喘、咽痛、疲乏等症状。目前中医治疗的临床报道多涉及肺、脾、胃等，但对于肺肾两虚证的治疗报道较少。在中医疾病传变中，肺属金，金生水，肺病则为母病，母病及子，则肾脏受累，故也可出现肾不纳气、肾气不足、肾不藏精等证型。本研究通过网络药理学探究淫羊藿、巴戟天在新冠感染肺肾两虚患者中的疗效机理。喘可治注射液由巴戟天、淫羊藿两味中药研制而成，其主要是基于补肾法治疗肺肾两虚患者的气喘、咳嗽等[1]。

网络药理学是一个基于系统生物学理论的研究学科，可分析生物信息系统与疾病网络，通过选取重要信号节点设计和解析各靶点药物分子，进而建立网络模式，将数据可视化，系统地阐明药物的药理作用与机制[2]，有助于新药或中药复方的临床试验，降低药物毒性反应。

本研究根据喘可治注射液的主要成分拟定淫羊藿-巴戟天中药复方汤剂，并采用网络药理学方法检测淫羊藿-巴戟天的主要活性成分与药理作用靶标，再通过数据聚类分析，进而构建药物-化合物-靶点网络系统，并利用软件分析数据信号通路，为淫羊藿-巴戟天在新冠感染肺肾两虚型的治疗提供更多理论参考。

1 资料与方法

1.1收集及筛选淫羊藿-巴戟天中的化合物 在中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php)的搜索框中分别输入“淫羊藿”及“巴戟天”，查找二者所含的全部化合物成分。在临床上，主要采用口服生物利用度(OB)和生物活性作用分子类药性(DL)评价活性组分能否成为有效成分[3]。故以OB≥30%、生物活性分子DL≥0.18为参考，利用TCMSP数据库筛选出两者所含符合标准的化学成分作为活性成分。

1.2靶标蛋白的筛选及药物-化合物-靶点网络的构建 在TCMSP中搜索出相应的目标蛋白，并利用Uniprot库(www.uniprot.org/)，将所有的目标蛋白与基因名核对，并剔除无对应的基因名称。利用Cytoscape3.7.2软件建立药物-化合物-靶点网络，并对其进行靶点和结构分析。

1.3淫羊藿-巴戟天治疗新冠感染肺肾两虚型潜在作用靶点预测 在GeneCards数据库(http：//www.genecards.org/)的搜索框中输入“Corona Virus Disease 2019”或“Novel coronavirus pneumonia”等关键词搜索与SARS-CoV-2有关的基因。并将药物靶点与疾病靶点进行配对，获得淫羊藿-巴戟天治疗新冠感染肺肾两虚型的潜在作用靶点。利用Omicshare的云台绘制Vene图，把药物和疾病的目标进行交叉映射，以获得交叉靶点。

1.4蛋白质互相作用(PPI)网络构建与分析 将淫羊藿-巴戟天作用于新冠感染肺肾两虚型的潜在靶标输入STRING数据库(https：//string-db.org/)，在“Multiple Proteins”界面录入潜在靶点的列表，并将其物种分类设定为“Homo Sapiens”(智人)，由此显示蛋白质之间的交互联系。以tsv格式存储，将该文件加载到Cytoscape3.7.2软件中，利用“Network analyzer”对该系统进行拓扑属性解析，从而得到该网络的核心靶标。

1.5靶点的通路分析 将靶标基因导入Funrich3.1.3进行基因本体(GO)富集分析，将生物过程(BP)、细胞组分(CC)、细胞功能(MF)按照靶标点数进行排序，获得条状图。将目标蛋白导入STRING数据库中进行京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路分析，并通过Omicshare(http：//omicshare.com/)绘制KEGG通路的气泡图，以达到数据的可视化。

2 结 果

2.1淫羊藿-巴戟天中活性化合物筛选 从TCMSP数据库中搜索获得的淫羊藿-巴戟天化合物，共筛选出43个符合标准的活性化合物，其中23个来自淫羊藿，20个来自巴戟天。见表1。

表1 淫羊藿-巴戟天中部分活性化合物的基本信息

续表1 淫羊藿-巴戟天中部分活性化合物的基本信息

2.2药物-化合物-靶点网络的构建与分析 通过Cytoscape软件组建药物-活性化合物-靶点相互作用网络(图1)。选取等级值与中心度值较高的节点是关键化合物或靶点。其中排名前5位的活性化合物依次是MOL000098(槲皮素)、MOL000422(山奈酚)、MOL000006(木樨草素)、MOL00358(β谷甾醇)、MOL004373(脱水淫羊藿黄素)，分别可与77、34、28、16、16个靶蛋白产生相互作用。

注：E-M为淫羊藿-巴戟天；菱形表示淫羊藿-巴戟天，八边形表示新冠感染肺肾两虚型，中间的矩形表示活性化合物，外周的圆形代表靶点基因。每个边表示活性化合物、靶标之间的交互作用。图1 药物-化合物-靶点网络图

2.3预测淫羊藿-巴戟天治疗新冠感染肺肾两虚型的潜在作用靶点 在GeneCards上总共获取了2 831个新冠感染的致病靶点。获得41个交叉靶点，即淫羊藿-巴戟天治疗新冠感染肺肾两虚型的作用靶点，见图2。

注：E-M为淫羊藿-巴戟天。图2 淫羊藿-巴戟天治疗新冠感染肺肾两虚型潜在靶点Vene图

2.4PPI网络构建与分析 淫羊藿-巴戟天的PPI网络见图3，将淫羊藿-巴戟天治疗新冠感染肺肾两虚型的41个潜在靶点基因输入STRING 中，获得PPI网络，包含367条边，平均节点度是17.9，见图4。从以上图表中可以看到，在不同的蛋白质间联系中，白细胞介素-6(IL-6)、血管内皮生长因子A(VEGFA)、胱天蛋白酶3(CASP3)、缺氧诱导因子1α(HIF1α)、细胞周期蛋白D1(CCND1)、人类表皮生长因子受体(EGFR)分别位列前6位，证明这些靶蛋白在治疗新冠感染肺肾两虚型中具有重要意义。

图3 淫羊藿-巴戟天PPI网络图

图4 淫羊藿-巴戟天治疗新冠感染肺肾两虚型的关键靶蛋白信息

2.5靶点GO富集分析及KEGG通路分析 将淫羊藿-巴戟天作用于新冠感染的41个潜在靶点输入Funrich 3.1.3软件，获得GO富集条目802个。共包含720个生物过程、29种细胞组分及53个细胞功能。把排名前10的富集基因条目通过Funrich3.1.3软件工具绘制条形图(图5)。生物过程主要体现在信号传递、代谢、细胞间通信、能量路径、蛋白质代谢等；细胞组分主要集中在细胞质、细胞核、细胞外、核浆等；细胞功能主要富集在转录因子活性、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性、氧化还原酶活性等。通过分析共获得125条KEGG通路，主要涉及磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K-Akt)信号通路、脂质核动脉粥样硬化、卡波西氏肉瘤疱疹病毒感染、肿瘤相关mRNA、人巨细胞病毒感染、艾巴氏病毒感染等。筛选前20条富集基因通路并绘制气泡图(图6)。Y轴代表所选信号通路，X轴表示各通路所占比例，气泡面积表示通路富集基因数大小，选取其中关键通路构建靶点-通路网络图(图7)。

图5 GO分子功能分析图

图6 淫羊藿-巴戟天治疗新冠感染肺肾两虚型KEGG通路富集气泡图

图7 靶点-通路网络图

3 讨 论

新冠感染是因感染SARS-CoV-2而引起的急性呼吸道传染性疾病，感染后的潜伏期多为1～14 d，疾病早期传染性较强，可经飞沫、密切接触、气溶胶等途径传播。新冠感染的常见临床表现有发热、干咳、乏力、鼻塞、咽痛、流涕、肌痛、腹泻、味觉或嗅觉减退等[4]，若不尽早干预，可迅速发展为重症，出现呼吸衰竭、循环障碍，甚者危及生命。

世界卫生组织在2020年1月31日发布了新冠感染的报告，新冠感染疫情是全球范围内的一次重大公共卫生事件。根据国家疾控中心相关数据，截至2022年1月，我国累计报告13万多例感染病例，全国性疫情已经基本得到控制，但随着变异毒株的传播，如Delta、Omicron，部分地区仍有报道散发病例。目前，全球多个国家中检出了SARS-CoV-2变异株，如Delta、Alpha、Eta、Lota、Beta等[5]，而奥密克戎变异株B.1.1.529于2021年11月24日首次在南非被发现，并于全球出现蔓延[6]。

在新冠感染的治疗方面，西医以对症、支持治疗居多。中医认为，该病属“湿毒疫”[7]、“寒湿疫”[8]等范畴，可配合中医相关辅助治疗，有利于改善症状，缩短治疗时间。新冠感染是一个全身性、系统性疾病，病变可累及肺外多个系统及脏器，外邪侵袭，首犯华盖，当邪毒化热，母病及子，消灼下焦阴液，或灼伤肾脏脉络，肾失纳气藏精之功，机体精微下泄，可见血尿、蛋白尿等[9]。肺失宣降，母病及子，导致肾不纳气、肾气不足，出现咳嗽、气喘等表现，同时可伴随疲倦乏力、腰膝酸软、形寒肢冷、小便清长、舌淡红、苔白、脉沉细等证候，所以肺肾两虚患者可予以补益先天之本而温阳补肾，纳气平喘止咳，顾护正气，有利于患者康复。喘可治注射液穴位注射可治疗肺肾两虚型肺系疾病，如支气管哮喘、慢性阻塞性肺疾病、支气管炎等，而其主要成分正是淫羊藿和巴戟天。

淫羊藿归肝经、肾经，性味辛、甘、温，可补肾助阳、祛风湿、强筋骨[10]。内含淫羊藿苷、淫羊藿次苷Ⅰ/Ⅱ、宝藿苷Ⅰ/Ⅱ等，均有雄激素样和植物雌激素样活性，可提高实验动物的性机能，促进外周T细胞免疫功能，促使血清超氧化物歧化酶活性增强。尚有抗骨质疏松、抗辐射、抗肿瘤、抗肺纤维化等作用[11-12]。淫羊藿苷能够调节T淋巴细胞的平衡，增强体内杀伤细胞的活性，从而提高机体的免疫力[13]。巴戟天归肾肝二经，性味甘辛、微温，亦可补益肾阳、祛风湿、强筋骨。其含有的单糖、多糖、树脂等可抗应激，巴戟天多糖可以作用于免疫器官及免疫相关细胞，能有效改善T细胞的免疫功能[14]。巴戟天能明显提高IL-2、IL-6、IL-10、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及γ干扰素的表达水平，对环磷酰胺所致免疫抑制小鼠具有良好治疗作用[15]。上述研究已明确了淫羊藿-巴戟天在调节免疫、抗应激、抗炎、抗肿瘤、抗肺纤维化等方面的作用，且能增强机体体液免疫及细胞免疫能力，从而为淫羊藿-巴戟天治疗新冠感染肺肾两虚型提供充分的相关药理依据。

本研究采用网络药理学分析方法，对43种淫羊藿-巴戟天的活性成分进行了分析，得到了41个淫羊藿-巴戟天对新冠感染肺肾两虚型的有效靶点，表明淫羊藿-巴戟天能够通过多靶点、多成分治疗新冠感染肺肾两虚型。通过“药物-化合物-靶点”的交叉网络分析检测关键活性化合物，按照中心度数值、等级值排列显示槲皮素、山奈酚、木樨草素、β谷甾醇位于前列。槲皮素主要存在于蔬果、绿茶等中[16]，具有抗炎、抗菌、祛痰止咳、免疫调节、抗氧化、抗肿瘤等功能[17]，其可抑制TNF-α、IL-6等促炎性细胞因子产生从而治疗脂多糖引起的肺炎[18]。山奈酚可抗病毒、抗氧化、抗炎、提高免疫力[19]，此外，山奈酚尚可调节miR21/PTEN 相关信号通路，导致非小细胞肺癌A549细胞增殖抑制，从而起到抗肿瘤功效[20]。有研究表明木樨草素同样可抑制A549细胞的活性、克隆形成、进一步迁移，与肌醇联合使用可下调p-PDK1和p-Akt的表达，从而增强其抑制作用[21]。β-谷甾醇具有多种生物活性，如抑制炎症、抑制细菌、抗氧化、降低胆固醇、类激素等[22]。β-谷甾醇可下调核因子-κB信号传导通路的活化，保护内毒素所致小鼠的肺损伤[23]。本研究筛选出的活性化合物涉及抗病毒、抗炎、肺损伤、抗肿瘤等方向，可覆盖病毒性肺炎。通过分析淫羊藿-巴戟天治疗新冠感染肺肾两虚型PPI网络中的40个靶点蛋白，经网络拓扑解析结果显示，IL-6、VEGFA、CASP3、HIF1α、CCND1、EGFR是淫羊藿-巴戟天治疗新冠感染肺肾两虚型的核心标靶。

IL-6是引发新冠感染患者“细胞因子风暴”的一种重要炎性细胞因子[24]，主导了新冠感染的发生与进展过程，其表达水平与病情严重程度呈明确正相关[25]。IL-6具有多重生物活性，是主要与细胞炎性反应相关的炎性细胞因子，IL-6的增加则可能对机体功能形成不良影响，有研究表明，IL-6受体阻断剂能够用于治疗新冠感染[26]，所以对新冠感染患者后期的细胞因子风暴的治疗尤为重要[27]。槲皮素与IL-6、血管紧张素转化酶2与SARS-CoV-2的亲和力接近推荐用药，作用于IL-6调节多条信号通路，从而证明其对新冠感染具有一定的疗效。VEGFA是促血管内皮细胞生长的因子，能够特异性地作用于内皮细胞，参与增加毛细血管通透性，进而诱导血管生成，尚可促进细胞迁移，抑制细胞凋亡。新冠感染患者由于体内细胞因子分泌，病灶血管渗透性增加，因而引起多器官系统的损伤，出现高热、肺炎、呼吸衰竭[28]。因此，通过调控VEGFA通道可缓解病毒性肺炎患者的症状。CASP3是一种与细胞死亡密切相关的蛋白酶，能够加速肺腺癌细胞的凋亡，降低其增殖、生长、迁移和侵袭能力[29]。CASP3与由细胞毒性T淋巴细胞颗粒酶B介导的杀伤作用靶细胞相关，是细胞坏死、凋亡信号传导中的关键性效应酶[30]。HIF1α的活性与血管生成相关，其与炎性反应、肿瘤生长及缺氧适应等相关。有研究表明，血清HIF1α高水平表达与老年慢性阻塞性肺疾病患者肺功能损伤加重相关[31]。CCND1表达异常时出现细胞周期紊乱，导致细胞无限增殖形成肿瘤。有研究表明，多种信号通路可通过抑制CCND1的表达，从而抑制肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭[32]。EGFR信号通路能够影响气道黏液的产生，当其通路开放增加，会导致气道内黏蛋白分泌增加。研究表明，通过抑制EGFR通路，能够下调黏蛋白5AC的表达，从而干预气道黏液的高分泌，能够有效治疗慢性阻塞性肺疾病[33]。以上就是淫羊藿-巴戟天治疗新冠感染肺肾两虚型的主要核心标靶，主要涉及炎性细胞因子、炎性反应、气道分泌、血管内皮生成、细胞增殖与凋亡等方面。

淫羊藿-巴戟天治疗新冠感染肺肾两虚型的靶点GO富集生物学过程主要包含信号传导、细胞间通信、代谢、能量路径、蛋白质代谢、转录因子活性、蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性、氧化还原酶活性、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性、细胞质、细胞核、核浆等。上述生物学过程在淫羊藿-巴戟天治疗新冠感染肺肾两虚型中均具有重要作用。KEGG通路富集分析共获得125条通路，主要包括PI3K/Akt信号通路、卡波西氏肉瘤疱疹病毒感染、脂质核动脉粥样硬化、人巨细胞病毒感染、艾巴氏病毒感染、肿瘤相关性mRNA等。本研究GO富集生物学过程及KEGG通路分析结果集中于病毒感染、细胞代谢、酶活性等方面，其中PI3K/Akt信号通路是新冠感染肺肾两虚型的重要靶标通路。

有研究表明，PI3K/Akt是病毒的一种重要靶标通路，与细胞生长、转录翻译、细胞凋亡等进程密切相关，参与多种病毒的调控，如流感病毒、柯萨奇病毒、呼吸道合胞病毒、轮状病毒[34-37]。PI3K/Akt信号通路主要分布在人体各个脏器组织，主要功能是控制炎症、抑制细胞凋亡、促进细胞增殖、控制代谢等，在呼吸道和肺部炎症中发挥了重要作用[38]。动物实验表明，PI3K抑制剂能够抑制甲型流感病毒感染引起的病毒性肺炎小鼠肺组织中一氧化氮生成及炎性反应[39]。此外，尚有研究证明，PI3K/Akt抑制剂可能是新冠感染治疗的潜在靶点[40]。因此，抑制PI3K/Akt信号通路可减少SARS-CoV-2感染后的肺损伤，能够用于治疗新冠感染。

综上所述，淫羊藿-巴戟天所含的化合物中槲皮素、山奈酚、木樨草素、β谷甾醇在治疗新冠感染肺肾两虚型中起到关键作用。淫羊藿-巴戟天中共检索获得65个潜在靶点，其中治疗新冠感染肺肾两虚型的交叉靶点是41个，即其中约63%的靶点均与治疗新冠感染肺肾两虚型相关。而治疗新冠感染肺肾两虚型的核心标靶为IL-6、VEGFA、CASP3、HIF1α、CCND1、EGFR，主要与炎性反应、细胞因子、气道高分泌、血管内皮生成、细胞增殖凋亡相关。而GO富集生物学过程和KEGG通路分析主要体现于相关病毒感染、细胞代谢、酶学活性等，其中PI3K/Akt信号通路是新冠感染肺肾两虚型的重要靶标通路，能够为新冠感染肺肾两虚型的治疗提供更多药理学依据。

本研究利用网络药理学阐述了淫羊藿-巴戟天治疗新冠感染肺肾两虚型是多靶点、多路径PPI的研究结果，为扩展喘可治注射液的临床应用范围提供了一定的药理学理论基础。但本研究仍存在一定的不足，中药复方汤剂的服用需因人制宜加以辨证论治而制定，且中药复方中的药物之间也可能存在相互作用，但目前数据库中的数据仍不全面，忽略了药物及成分之间相互作用、中药成分药量的影响因素等，所以其具体机制尚需更进一步的深入研究及临床试验证明。