盘状结构域受体1在七氟烷麻醉诱导老年大鼠认知功能障碍中的作用研究*

张学长，汤杰云，王鹏程

(黄淮学院直属附属驻马店市中心医院麻醉科，河南 驻马店 463000)

术后认知功能障碍(POCD)是指手术麻醉后出现的认知、学习、记忆及精神运动等方面障碍。目前研究认为，POCD发病机制与神经炎症、氧化应激及神经元凋亡密切相关[1-2]。因此，抑制神经炎症已成为POCD研究的重点机制。盘状结构域受体1(DDR1)是与炎性反应相关，且参与了脑损伤诱发的神经功能障碍[3-4]。因此，以DDR1为研究靶标可能是POCD神经炎性反应的新机制。七氟烷(Sevo)是临床上常用的吸入性麻醉剂，已被证实能够引起海马神经炎性反应和神经元凋亡诱发POCD的发生[5]。为此，本研究拟通过七氟烷吸入麻醉构建POCD大鼠模型，探究DDR1在海马神经元炎性反应中的作用，以期为POCD的机制研究提供新的思路。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1动物 SPF级雄性SD大鼠，月龄20～22个月，体重500～600 g，购自湖南斯莱克实验动物有限责任公司[SCXK(湘)2019-0006]。

1.1.2主要试剂 七氟烷(江苏恒瑞医药股份有限公司)，DDR1抑制剂(DDR1-IN-5，美国MedchemExpress公司，货号：HY-133669)，白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)酶联免疫吸附试验(ELISA)测定试剂盒(北京中杉金桥公司，货号：TA504958、TA500065、TA500062)，苏木精-伊红(HE)染色试剂盒(碧云天生物技术，货号：C0105S),免疫组织化学(免疫组化)检测试剂盒(北京中杉金桥公司，货号：SP-9001)，DDR1单克隆抗体(Cell Signaling Technology公司，货号：#5583)，β-actin单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗大鼠、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(碧云天生物技术，货号：AF5001、A0192、A0208)。

1.1.3主要仪器 多功能酶标仪(长春乐镤科技有限公司，型号：LP-5117)，荧光倒置显微镜(日本奥林巴斯Olympus，型号：CKX53)，高速冷冻离心机(湖南可成仪器设备有限公司，型号：H3-18KR)，凝胶成像系统(美国Bio-Rad伯乐公司，型号：Gel Doc XR+)。

1.2方法

1.2.1动物造模与分组 将实验SD大鼠随机分为对照组、DDR1抑制剂组、七氟烷麻醉组、DDR1 抑制处理组，每组各10只。对照组大鼠常规培养，定量吸入空气；DDR1抑制剂组大鼠以DDR1抑制剂5 μg侧脑室注射，30 min后定量吸入空气；七氟烷麻醉组大鼠经持续性吸入3%七氟烷6 h构建认知功能障碍模型；DDR1抑制剂处理组大鼠以DDR1抑制剂5 μg侧脑室注射，30 min后吸入3%七氟烷6 h。

1.2.2Morris水迷宫实验[1]七氟烷麻醉术后1 d，行Morris水迷宫实验，将水迷宫划分为4个象限，并随机选取一个象限放置隐蔽平台，将大鼠从4个象限随机放入水中，记录大鼠寻找到平台的时间，即为逃避潜伏期。大鼠经过5 d平台寻找训练：4个象限入水点，每天训练1次，每次间隔20 min，第5天记录各组大鼠逃避潜伏期时间。空间探索实验：第6 天撤去隐蔽平台，将大鼠从4个象限中任一象限随机入水，记录大鼠60 s内穿越平台的次数及目标象限停留时间的占比。

1.2.3ELISA检测海马组织IL-1β、IL-6、TNF-α水平 海马组织碾磨后经细胞裂解液裂解，于4 ℃下12 000 r/min(离心半径=6 cm)离心10 min，取上清液，蛋白定量后采用ELISA检测试剂盒检测海马组织IL-1β、IL-6、TNF-α水平。

1.2.4HE染色观察海马神经元形态变化 麻醉后将大鼠颈椎脱臼处死，摘取脑片(视交叉至漏斗柄)，组织固定、石蜡包埋、切片，行HE染色，并于200倍镜下观察海马CA1区域形态变化。半定量评估海马CA1区域神经元损伤。1级：海马CA1区域分散零散损伤神经元(<20%)；2级：海马CA1区域存在少量损伤神经元(20%～40%)；3级：海马CA1区域有中等数量损伤神经元(>40%～60%)；4级：海马CA1区域有大量损伤神经元(>60%～80%)；5级：海马CA1区域神经元存在广泛性损伤(>80%～100%)。

1.2.5免疫组化检测海马组织DDR1表达 海马组织切片经内源性过氧化物酶阻断剂阻断、抗原修复、组织封闭后，滴加DDR1单克隆抗体(1∶500)，孵育过夜，对应二抗孵育2 h，滴加DAB显色液，于400倍显微镜下观察DDR1相对表达量。

1.2.6Western blotting检测海马组织DDR1蛋白表达 按照每孔30 μg上样，经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，DDR1蛋白经湿转法转膜至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上，孵育DDR1单克隆抗体，4 ℃过夜，对应二抗孵育2 h。PVDF洗膜，滴加显影液显影，并予Gel Doc XR+系统拍照，最后进行定量检测。

2 结 果

2.1各组大鼠认知功能障碍情况比较 与对照组比较，七氟烷麻醉组大鼠逃避潜伏期时间延长，目标象限停留时间占比降低，穿越平台次数减少，差异均有统计学意义(t=13.89、8.21、6.46，P<0.001、<0.001、<0.001)。与七氟烷麻醉组比较，DDR1抑制剂处理组大鼠逃避潜伏期时间降低，目标象限停留时间占比升高，穿越平台次数增加，差异均有统计学意义(t=5.77、5.61、3.67，P<0.001、<0.001、=0.002)。见表1。

表1 各组大鼠认知功能障碍情况比较

2.2各组大鼠海马组织炎症因子水平比较 与对照组比较，七氟烷麻醉组大鼠海马组织IL-1β、IL-6、TNF-α水平显著升高，差异均有统计学意义(t=20.67、13.73、35.15，P<0.001、<0.001、<0.001)。与七氟烷麻醉组比较，DDR1抑制剂处理组大鼠海马组织IL-1β、IL-6、TNF-α水平显著降低，差异均有统计学意义(t=10.84、7.22、16.38，P<0.001、<0.001、<0.001)。见表2。

表2 各组大鼠海马组织炎症因子水平比较

2.3各组大鼠海马CA1区域神经元损伤情况比较 对照组和DDR1抑制剂组大鼠海马CA1区域神经元排列整齐，结构完整。七氟烷麻醉组大鼠海马CA1区域神经元排列紊乱，部分神经元细胞核固缩，嗜酸性粒细胞数目明显增多，海马神经元损伤评分较对照组增加，差异均有统计学意义(t=11.91，P<0.001)。与七氟烷麻醉组比较，DDR1抑制剂处理组大鼠海马CA1区域神经元损伤减轻，评分降低，差异有统计学意义(t=4.92，P<0.001)，大部分神经元结构正常，酸性粒细胞数目明显减少。见图1、表3。

表3 各组大鼠海马CA1区域神经元损伤评分比较

注：A.对照组；B.DDR1抑制剂组；C.七氟烷麻醉组；D.DDR1抑制剂处理组。图1 各组大鼠海马CA1区域形态学变化(HE染色，200×)

2.4各组大鼠海马组织DDR1蛋白相对表达比较 免疫组化检测结果显示，与对照组比较，七氟烷麻醉组大鼠海马组织DDR1表达明显增加；与七氟烷麻醉组比较，DDR1抑制剂处理组大鼠海马组织DDR1表达明显降低。Western blotting检测结果显示，与对照组比较，七氟烷麻醉组大鼠海马组织DDR1蛋白表达水平明显增加，差异有统计学意义(t=24.86，P<0.001)。与七氟烷麻醉组相比，DDR1抑制剂处理组大鼠海马组织DDR1蛋白表达水平明显降低，差异有统计学意义(t=15.04，P<0.001)。见图2、表4。

注：A.免疫组化检测DDR1蛋白表达(HE染色，400×)；B.Western blotting检测DDR1表达。图2 各组大鼠海马组织DDR1蛋白表达

表4 各组大鼠海马组织DDR1蛋白相对表达量比较

3 讨 论

七氟烷是临床全身麻醉的首选药物，其具有诱导迅速、苏醒快、对呼吸及循环抑制轻等优势[6]。众多研究均已证实七氟烷吸入性麻醉能够诱导海马神经元损伤及老年认知功能障碍，但是有关其机制尚不完全清楚。

本研究首先通过老年大鼠七氟烷吸入性麻醉构建POCD模型，结果显示：与对照组比较，七氟烷吸入麻醉组大鼠出现典型的认知功能障碍，主要表现为逃避潜伏期时间延长，目标象限停留时间占比降低和穿越平台次数减少。海马CA1区域神经元损伤评分增加表明模型构建成功。既往研究已证实，七氟烷能够诱导大鼠认知功能障碍，其机制与海马神经元炎性细胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)释放增加，从而导致海马神经元凋亡增加相关[7-8]。本实验研究发现，与对照组比较，七氟烷麻醉组大鼠海马组织IL-1β、IL-6、TNF-α水平显著升高，与黄运伯等[1]研究结果一致。本研究与以往文献报道共同表明，七氟烷诱导POCD与促进海马神经炎症，诱发细胞凋亡相关。因此，在七氟烷诱导的认知功能障碍中对海马神经元炎性反应的机制进行研究具有重要意义。DDR1是受体酪氨酸蛋白激酶家族成员之一，广泛参与细胞增殖、凋亡、纤维化及炎症等病理生理过程[9-10]。有研究发现，DDR1表达在大鼠局灶性缺血后升高，抑制DDR1能够显著减少大鼠脑缺血损伤发生[11]。另外，在氧剥夺损伤的神经元细胞中DDR1蛋白表达显著增加，抑制DDR1表达能够促进皮质神经细胞存活，改善缺氧、缺糖诱导的大鼠皮质神经细胞损伤[12-13]。上述研究表明，DDR1在多种诱因下的神经损伤中发挥重要作用。本研究发现，与对照组比较，七氟烷麻醉组大鼠海马组织DDR1蛋白表达明显增加，提示DDR1在海马神经元损伤中扮演损伤因子角色。为明确DDR1在七氟烷诱导海马神经损伤中的作用，本研究通过大鼠侧脑室注射DDR1抑制剂观察七氟烷对老年大鼠海马神经元损伤的影响，结果显示，与七氟烷麻醉组比较，DDR1抑制剂处理组能够改善老年大鼠认知功能障碍，其机制与降低DDR1蛋白表达，抑制IL-1β、IL-6、TNF-α释放，减轻海马CA1区域神经元损伤有关。

综上所述，七氟烷麻醉诱导的老年大鼠认知功能障碍与海马组织DDR1蛋白表达增加，促进海马神经元炎性反应相关。