不同因素对黄芩苷镁治疗非酒精性脂肪性肝炎大鼠模型影响研究*

管秀璐，沈诗嫄，张 琳，宋靖宇，刘金霞，常金花，毛晓霞，刘翠哲△

(承德医学院：1.河北省中药研究与开发重点实验室；2.病原生物学教研室，河北 承德 067000)

非酒精性脂肪性肝炎(NASH)又称代谢性脂肪性肝炎，是病理变化与酒精性肝炎相似但无过量饮酒史的临床综合征，易发于中年且超重肥胖个体[1]。NASH是非酒精性脂肪性肝病的炎症亚型，可进展为肝纤维化、肝硬化甚至肝癌等终末期肝病，是慢性肝病的重要病理阶段[2]。NASH的发病率和致死率在全球范围内呈上升趋势，我国超五分之一的人受到NASH等肝脏疾病的困扰。NASH的发生可能是环境、遗传、饮食和代谢等因素相互作用的结果,其组织病理学改变可能是由于多种机制所致,包括脂肪酸堆积、线粒体功能障碍、自由基的产生、氧化应激、脂质过氧化和内毒素介导的细胞因子释放等[3]。目前，临床上主要是从改善代谢功能、脂肪性变和抗炎等方面进行NASH治疗药物的研发，但尚缺乏有效治疗NASH的药物[4-5]，现阶段防治NASH的手段主要是控制饮食和锻炼[6]，但绝大多数患者难以有效减重，更难长期维持健康体重，因此，迫切需要寻找新型有效的NASH治疗药物。

黄芩是临床常用中药[7]。黄芩苷是黄芩的主要有效成分[8]。现代医学研究发现，黄芩苷具有抗炎、抗氧化、抗脂质沉积和保肝等作用[9-12]，且黄芩苷对病毒性肝炎、酒精性肝炎、肝纤维化等疾病均具有一定的保护作用[13-14]。在2020版《中华人民共和国药典》中收录的中药处方制剂，如清开灵注射剂、三黄片和银黄颗粒等制剂均采用黄芩苷代替黄芩药材投料[15]。但目前黄芩苷存在溶解度差、生物利用度低等问题[16]。有文献报道，采用药剂学手段和结构修饰等方法改善这一问题，然而这些方法工艺复杂，难以适应工业生产[17-18]。针对以上问题，有学者从黄芩水提取物中分离得到一种水溶性较好的黄芩苷，即黄芩苷镁盐(结构为1个镁离子结合2个黄芩苷分子)[19]。有研究证实，黄芩苷能够改善NASH大鼠的炎性反应和脂质沉积情况[20]，但黄芩苷镁能否治疗NASH尚缺乏相关研究。

本研究拟通过高脂饮食(HFD)建立Sprague-Dawley(SD)大鼠NASH模型，通过测定大鼠的体重、肝湿重、肝指数、血清生化指标及病理等情况，比较不同造模时间、给药时间和给药剂量对大鼠NASH成模及黄芩苷镁对NASH模型大鼠治疗作用的影响，旨在为后期进一步研究黄芩苷镁治疗NASH的作用机制提供研究基础。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 选取雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠64只，体重(120±20)g。大鼠购自北京华阜康生物股份有限公司，动物生产许可证号：SCXK(京)2019-0008，动物实验设施许可证编号：SYXK(冀)2017-001。高脂饲料采用88%基础饲料+10%猪油+2%胆固醇的配比制得，购自北京华阜康生物股份有限公司。动物伦理号：LAC2021032。

1.1.2实验仪器 MSE125P电子分析天平(德国塞多利斯集团)，JA-2003电子天平(上海精科天平有限公司)，R2002型旋转蒸发仪、恒温水浴锅(上海谱振生物股份有限公司)，1260型高效液相色谱仪(美国安捷伦有限公司)，R510-25 RWD麻醉机(瑞沃德科技有限公司)，Velocity 14R型高速低温离心机(澳大利亚生命动力有限公司)，LW C400全自动生化分析仪(深圳蓝韵医疗器械)，RM2235型石蜡切片机和EG1150型石蜡包埋机(德国Leica公司)，Excelsior TMES 型自动组织脱水机(美国赛默飞公司)，DM6000电子显微镜(德国Leica公司)，LGJ-22D冷冻干燥机(北京四环有限公司)，DW-HL528S超低温冰箱(中科美菱有限公司)，4510070移液枪、1 mL移液枪枪头(德国赛默飞公司)。

1.1.3实验试剂 黄芩苷镁(纯度80.98%，承德医学院中药研究所刘翠哲教授课题组自制)；苏木精-伊红(HE)染色液(珠海贝索生物技术有限公司)；甲醇(色谱纯，美国迈瑞达科技股份有限公司)；磷酸(色谱纯，美国迈瑞达科技股份有限公司)；谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)和低密度脂蛋白(LCL-C)试剂盒(宁波普瑞柏生物技术有限公司)。

1.2方法

1.2.1溶液配制 精密称取黄芩苷镁冻干粉0.14、0.28、0.56、0.84 g，分别溶于4 mL灭菌注射用水中，得到黄芩苷镁25、50、100、150 mg/kg剂量溶液。

1.2.2实验分组及干预 将SD大鼠随机分为6组，分别为空白组、模型组、黄芩苷镁组1～4组(剂量分别为25、50、100、150 mg/kg)，空白组和模型组分别16只，其余每组各8只。适应性饲养1周后，空白组喂饲基础饲料，模型组及黄芩苷镁各剂量组喂饲高脂饲料。在第6、8周末禁食、禁饮12 h后，从空白组和模型组中分别随机选取4只大鼠麻醉后腹主动脉取血处死，其余剩余大鼠及给药组大鼠继续喂饲高脂饲料，同时给药组尾静脉注射黄芩苷镁，空白组和模型组尾静脉注射生理盐水。给药1周后，每组随机选取4只大鼠处死；给药2周后，所有大鼠禁食、禁饮12 h后麻醉，腹主动脉取血处死并取肝组织。

1.2.3指标测定 实验过程中，每天在同一时间测量大鼠体重，并观察大鼠的饮食、活力和毛色等情况；处死前对大鼠进行称重，处死后取出大鼠完整肝组织，称重，计算肝指数(肝湿重/体重×100%)。大鼠麻醉后充分暴露腹腔进行腹主动脉取血，将血液样本离心后取上清液，采用全自动生化仪测定大鼠血清HDL-C、LDL-C、TC、TG、ALT、AST水平。

1.2.4病理检查 各组大鼠处死后，取新鲜肝组织浸泡在4%甲醛溶液中固定，甲醛固定完成后，进行洗涤、脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片、展片、烤片等处理，然后进行HE染色，光镜下观察肝组织的病理学变化，参照《非酒精性脂肪性肝病中西医结合诊疗共识意见(2017年)》[21]，并计算非酒精性脂肪性肝病活动度积分(NAS)。

2 结 果

2.1造模时间对NASH大鼠模型形成的影响 造模6周时，与空白组比较，模型组大鼠体重、肝湿重和肝指数均显著增加，差异均有统计学意义(P<0.05)；模型组大鼠血清中ALT、AST、TC、TG、LDL-C水平升高，HDL-C水平降低，但差异均无统计学意义(P>0.05)；造模8周时，与空白组比较，模型组大鼠毛发粗糙，活动减弱，体重、肝湿重和肝指数，以及血清中ALT、AST、TC、TG、LDL-C水平明显升高，HDL-C水平明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1、2。如图1病理结果显示，造模8周时模型组大鼠肝脏表面有油脂覆盖，边缘轮廓钝厚，炎症细胞浸润，与造模6周时的模型组相比，肝指数和血清生化指标较空白组的差异更大。

表1 不同造模时间的大鼠体重相关指标比较

表2 不同造模时间的大鼠血清生化指标比较

注：A.造模6周空白组；B.造模6周模型组；C.造模8周空白组；D.造模8周模型组。图1 造模6、8周空白组和模型组大鼠肝脏病理图(HE染色，400×)

2.2给药时间和剂量对黄芩苷镁治疗NASH模型大鼠各指标的影响 给药1周时，与模型组比较，空白组各指标差别明显，差异均有统计学意义(P<0.05)；黄芩苷镁1组各指标无显著性变化，差异均无统计学意义(P>0.05)；黄芩苷镁2组大鼠部分指标水平降低，但差异均无统计学意义(P>0.05)；黄芩苷镁3、4组大鼠体重相关指标有所下降，但差异均无统计学意义(P>0.05)；黄芩苷镁3组大鼠血清ALT、LDL-C水平降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，AST、TC、TG水平降低，HDL-C水平升高，但差异均无统计学意义(P>0.05)；黄芩苷镁4组大鼠血清ALT、AST、TC、TG及LDL-C水平降低，HDL-C水平升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。给药2周时，与模型组比较，黄芩苷镁1组各指标无显著性变化，差异均无统计学意义(P>0.05)；黄芩苷镁2组大鼠肝湿重、ALT、AST、TC、TG水平显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，其余指标稍有变化，但差异无统计学意义(P>0.05)；黄芩苷镁3、4组大鼠体重、肝湿重和肝指数显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，血清生化指标ALT、AST、TC、TG、LDL-C的水平显著降低，HDL-C水平显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3～6。

表3 不同给药时间各组大鼠体重相关指标比较

2.3给药时间和剂量对黄芩苷镁治疗NASH病理学的影响 如图2病理结果显示，空白组大鼠肝索排列整齐，肝组织结构正常。与模型组比较，黄芩苷镁1组大鼠NAS无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05)；脂肪变性程度强，气球样变多，有炎性细胞浸润，黄芩苷镁2～4组大鼠的脂质沉积和炎性反应均显著改善，NAS均显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。特别是黄芩苷镁4组，从图2可见其对病理损伤的改善作用更明显，且NAS更低。给药2周时各组大鼠NAS比较见图3。

A.空白组；B.模型组；C.黄芩苷镁1组；D.黄芩苷镁2组；E.黄芩苷镁3组；F.黄芩苷镁4组。图2 给药2周时各组大鼠肝脏病理图(HE染色，400×)

表4 不同给药时间各组大鼠ALT、AST指标比较

表5 不同给药时间各组大鼠TC、TG指标比较

表6 不同给药时间各组大鼠HDL-C、LDL-C指标比较

注：与黄芩苷镁4组比较，aP<0.05，bP<0.01；与模型组比较，cP<0.01。图3 给药2周时各组大鼠NAS比较

3 讨 论

近年来，NASH的发病率逐年上升，已严重威胁到人类身体健康[22]，目前尚缺乏有效的治疗手段。NASH发病机制复杂且造模方式多样，因此，NASH动物模型的成功复制对于深入研究NASH的发病机制和合理治疗意义重大。饮食模型是最常用的NASH模型，HFD诱导的NASH可引起增重、肥胖和胰岛素抵抗等，与人类的发病机制相近[23]，所以本研究采用HFD诱导方式建立NASH大鼠模型，通过比较造模6、8周时体重、肝湿重、肝指数、血清生化指标和病理情况，最终选取8周为HFD诱导NASH的成模时间。

黄芩苷可以抑制毒性物质对肝细胞的损伤[24]，减轻肝损伤过程中的炎性反应及纤维化改变；在急性肝损伤模型中，黄芩苷能够显著改善肝功能，减轻肝脏病理损伤[25]。目前，黄芩苷在调节脂质代谢、胰岛素抵抗、肝细胞凋亡和氧化应激方面的作用已被证实[26-28]。QIAO等[29]研究发现，黄芩苷对四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化具有治疗作用；ZHAO等[30]研究者运用葛根素、黄芩苷和小檗碱联合治疗来改善高脂饮食诱导的大鼠NASH。基于此，本研究评价了黄芩苷镁对NASH大鼠模型的治疗作用，结果显示，尾静脉注射黄芩苷镁1周时治疗效果不明显，给药2周时，NASH大鼠体重相关指标、血清生化指标和病理状况明显好转。通过考察不同给药剂量下大鼠血清指标及病理学改变发现，给药剂量为25 mg/kg时对NASH大鼠治疗效果不明显，50、100、150 mg/kg对相关指标均具有不同程度的改善作用，且呈剂量依赖性。

综上所述，黄芩苷镁对NASH大鼠模型具有治疗作用，且呈剂量依赖性，给药2周时治疗效果更好，为后期进一步深入研究黄芩苷镁治疗NASH的作用机制奠定了研究基础。