受精卵原核面积差及合子胞质平均直径对单囊胚移植活产的影响

邓星 韩艳 彭伟 段超群 李清 刘珍 解兴兴

随着辅助生殖技术(assisted reproductive technology,ART) 的发展,胚胎质量的优劣成为成功进行体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization -embryo transfer,IVFET) 治疗的关键因素之一［1］。因此,选择具有发育潜力的胚胎移植来实现单胎妊娠及健康活产是IVF-ET 的最终目标。近年来单囊胚移植被当做在IVF-ET 治疗中达到最终目标的最有效措施。文献报道［2,3］在IVFET 中行单囊胚移植不仅可以明显降低多胎妊娠率,同时可以获得更好的产科分娩结局。目前胚胎形态学评分系统由于无创方便,一直被用作评估胚胎发育潜力的主要工具。然而,以往的研究报道,人类雌雄原核的大小几乎相同［4］。与两原核(two pronuclear,2PN)直径相差＜4 μm 的受精卵相比,2PN 直径相差＞4 μm 的受精卵,其胚胎阻滞率和嵌合率明显升高［5］。此外,另有两项研究报道,不同原核大小的合子在第3 天胚胎中导致胚胎分裂停止和嵌合现象的发生率显著高于相似大小的原核大小的合子［5,6］。Otsuki 等［7］通过研究2PN 直径与活产的关系,认为在原核核膜消失之前即时评估每个原核的大小得出2PN 直径差异越小更有利于健康活产的结论。因此,本研究通过体外受精(IVF)后20 h 这个特定时间,测量合子胞质平均直径、原核直径,计算2PN 面积差,并探讨合子胞质平均直径和2PN 面积差对活产的影响。现报告如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 回顾性分析宜春市妇幼保健院辅助生殖科2017 年7 月～2021 年7 月行助孕治疗患者的194 个改良长方案新鲜第5 天(D5)单囊胚移植周期,纳入标准：①年龄20～40 岁；②进行D5 新鲜单囊胚移植；③改良长方案促排卵［8］；④宫腔镜检查证实无宫腔粘连。排除标准：①患者有甲状腺功能亢进、高泌乳素血症、多囊卵巢综合征等内分泌疾病；②合并一侧或双侧输卵管积液；③有子宫内膜异位症患者。由于所有数据都是匿名的,并且是回顾性资料分析,经医院生殖医学伦理委员会讨论免除知情同意。

1.2方法

1.2.1合子胞质平均直径及原核直径测定 体外受精后20 h,使用激光破膜成像软件(RI,英国)成像及测量2PN 直径和合子胞质平均直径。所有胚胎培养5 d,选择D5 单囊胚移植。从每例患者的存档移植胚胎图像中,选择所移植的胚胎进行原核测量。合子胞质平均直径的测量不包括透明带。所有操作均由一名经验丰富的胚胎学家进行形态学评估及图片的测量工作,另一名胚胎学家进行审核。

原核面积计算方法：S=π×［(A-A)/2］×［(B-B)/2］。其中A-A 为椭圆的短轴长,B-B 为椭圆的长轴长。2PN 面积差为两个原核面积的差。

1.2.2囊胚评分 按照Gardner 囊胚评分法对D5/D6形成的囊胚进行评分,对于评分≥3BB 级的囊胚定义为优质囊胚；对于滋养外胚层和内细胞团不同时评为CC 级别的囊胚定义为可移植囊胚。

1.3统计学方法 采用SPSS22.0 统计学软件对研究数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差()表示,采用t 检验；计数资料以率(%)表示,采用χ2检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1活产组和未活产组的临床资料及测量指标比较194 个新鲜D5 单囊胚移植周期,活产组 116 个移植周期,未活产组78 个移植周期。两组女方年龄、不孕年限、体质量指数、bFSH、bE2、AFC、bLH、bAMH、Gn 启动总剂量、Gn 启动总天数、HCG 日内膜厚度、HCG 日血E2、HCG 日血LH、HCG 日血P、穿卵数、获卵数、MⅡ卵数、2PN 面积差比较差异均无统计学意义(P＞0.05)；活产组移植优胚数多于未活产组,合子胞质平均直径长于未活产组,差异具有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

表1 活产组和未活产组的临床资料及测量指标比较()

表1 活产组和未活产组的临床资料及测量指标比较()

注：与未活产组比较,aP＜0.05

2.2不同合子胞质平均直径的临床资料及测量指标比较 194 个新鲜D5 单囊胚移植周期,根据合子胞质平均直径不同分为A组(＜115.0 μm,158 个移植周期)和B组(≥115.0 μm,36 个移植周期)。两组不孕年限、体质量指数、bFSH、bE2、AFC、bLH、bAMH、HCG 日内膜厚度、HCG 日血E2、HCG 日血LH、HCG 日血P、穿卵数、获卵数、MⅡ卵数、总冷冻、冻囊胚、总受精、正常受精、总卵裂、获卵率、成熟卵率、总受精率、正常受精率、正常卵裂率、D3 优胚率、囊胚形成率、优囊率、移植优胚数比较差异无统计学意义(P＞0.05)；B组女方年龄、Gn 启动总剂量、活产率均高于A组,Gn 启动总天数长于A组,差异具有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

表2 不同合子胞质平均直径的临床资料及测量指标比较［ ,n(%)］

表2 不同合子胞质平均直径的临床资料及测量指标比较［ ,n(%)］

续表2

3 讨论

本研究共纳入194 个新鲜D5 单囊胚移植周期,活产组 116 个移植周期,未活产组78 个移植周期,两组女方年龄、不孕年限、体质量指数、bFSH、bE2、AFC、bLH、bAMH、Gn 启动总剂量、Gn 启动总天数、HCG 日内膜厚度、HCG 日血E2、HCG 日血LH、HCG日血P、穿卵数、获卵数、MⅡ卵数、2PN 面积差比较差异均无统计学意义(P＞0.05)；活产组移植优胚数多于未活产组,合子胞质平均直径长于未活产组,差异具有统计学意义(P＜0.05)。

以往在小鼠研究中发现受精卵雄原核的大小一般比雌原核大。然而此前研究报告称,人类男性和女性原核的大小几乎相同［9］。在此基础上,有研究表明,两个原核大小相似的受精卵囊胚发育率明显高于两个原核大小不等的受精卵［10,11］。另一项研究报道,不等大小的原核与较慢卵裂率和胚胎质量下降有关［12］。也有报道称,原核大小不同的受精卵产生的胚胎染色体异常发生率较高［13］。研究表明,受精卵在受精16～18 h后的原核形态与其后续的发育潜能存在相关性［14］。此外,体外受精胚胎相关原核期受精卵的形态和非整倍体的关系已被报道［15］。有两项研究表明,两个原核大小相似的受精卵囊胚发育率明显高于两个原核大小不等的受精卵［10,11］。本研究中活产组与非活产组的2PN面积差比较差异无统计学意义(P＞0.05)。在2017 的研究中［8］,在原核消失前观察雌雄原核的大小是相似的,才能导致健康活产。通常观察原核是在受精后16～18 h,确认是否正常受精,这相当于原核消失之前的4 h。然而,这项研究发现,成功分娩患者原核直径的差异在原核消失前立即进行测量时明显小于原核消失前4 h。因此,在原核消失前,通过时差成像系统测量原核直径,可以更准确地预测哪些胚胎会导致健康婴儿的出生［8］。因此,本研究在IVF 受精后20 h 对两组进行了2PN 直径的精确测量,测量后计算面积差并进行比较,两组无显著差异。此外,在以上研究中［8］,原核尺寸的分析仅限于二维测量。本研究也是进行的图片测量,当三维分析成为可能时,就有可能获得更精确的数据。近几年时差成像系统被用于胚胎的选择,以期提高活产率。目前,胚胎植入前遗传学筛查可以对胚胎的染色体非整倍体进行检测,但费用较高,临床中不是所有的胚胎都能进行植入前遗传学筛查。临床中希望掌握预测活产率的评价指标,可为单个囊胚挑选移植提供临床依据。本研究关注的是成功活产率,而不仅仅是囊胚发育和妊娠率［16,17］。由于成功分娩的患者在原核消失之前,2PN 直径差异很小,所以2PN 直径的巨大差异可能与染色体异常有关。此外,无论胚胎如何发育,在体外受精胚胎中原核的大小可能与染色体的体积有关。例如,当由于染色体分离异常大量的染色体挤进第二个极体时,雌性原核的大小可能会因为受精卵母细胞中染色体的体积变小而变小。尽管还需要进一步研究来阐明这一假说,但在原核消失之前,雌雄原核的大小差异可能是选择或排除染色体正常或异常胚胎的一个有用的测量方法。本研究对部分流产患者做了绒毛染色体检查,结果多为异常,与以上研究［8］中原核消失之前的大小差异越小,活产率越高的结果相似,因此测量受精卵原核直径的差异可以作为早期胚胎发育潜能的有效参评估考指标。在相关研究中［18］,原核的出现和发育是一个动态的过程,在受精之后出现从无到有、从小到大的再到消失的过程。本研究是在IVF受精后20 h 进行测量,不同的原核直径可能代表原核的不同发育阶段,在一个特定的时间(20 h)进行原核直径测量,同一时间出现原核不同发育阶段是否可能影响胚胎发育潜力,同时本研究中移植均为D5 的囊胚,根据文献报道原核面积差超过一定范围与囊胚形成率降低有关。这些问题均需要后续进一步的研究。

本研究依据受精后胞质平均直径将移植周期分为两组,A组＜115.0 μm,158 个移植周期,活产88 例,活产率为55.7%。B组≥115.0 μm,36 个移植周期,活产28 例,活产率为77.8%。结果显示,两组活产率比较差异具有统计学意义(P＜0.05)。研究表明［19］,胞质平均直径在105.96～118.69 μm 的卵母细胞更有可能发育成为高质量的D5 囊胚。所提供的预测模型都没有考虑到有关卵母细胞质量的信息,以及它们在受热和受精后发育成囊胚的几率。将卵母细胞平均直径与患者年龄相结合,可以提高预测模型的准确性。卵母细胞平均直径可能是胚胎发育到囊胚期的另一个预测因素。这种非侵入性的测量方法可以帮助需要生育能力保存的患者卵子冷冻保存决策的制定。如果为了保持生育能力而进行的促排卵周期导致一组卵母细胞具有不利特征(例如,直径过大、细胞质暗),则可能建议进行额外的促排卵周期,以提高女性活产的几率［19］。肥胖妇女卵子胞质直径与妊娠相关,胞质直径较大且透明带厚度较薄的卵子其妊娠结局越好［20］。研究［21］发现直径较小的卵母细胞减数分裂成熟受到抑制,也就是说在卵母细胞生长的最后阶段,若增加卵母细胞的大小,卵母细胞与透明带(ZP)内表面的连接增加了,机体排出和卵母细胞减数分裂恢复使卵母细胞体积变小。研究认为卵母细胞直径可用作预测胚胎卵裂时间的标志。本研究结果也证实受精后合子胞质平均直径与活产率有显著关系。所以进一步探讨合子胞质平均直径作为独立因素对活产结局的影响值得进一步的研究。

本研究局限性主要为：①没有避免其他潜在的因素；②由于患者样本数量限制,所以本研究结果还需要进一步扩大样本研究；③本研究为移植D5 囊胚,在受精后第 1 天的原核期,异常的原核大小面积差是否可预测囊胚形成率值得进一步大样本的研究。影响IVF 活产的因素有很多,任何单一的因素都很难准确判断临床治疗中能否活产。如何权衡所有的相关因素,一直是临床研究的课题。

综上所述,合子胞质平均直径可纳入胚胎评估标准的辅助指标中,以期增加患者活产的机会。