血清外泌体源性microRNA对类风湿性关节炎的诊断意义

贾 筠，杜望磊，肖广智，赵春红，杨西超 (空军军医大学第一附属医院临床免疫科，陕西 西安 710032)

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种慢性炎症性自身免疫性疾病，致残率较高[1]。其病理改变以关节滑膜炎症性增生、软骨及骨质不可逆性破坏为特征。早期诊断和治疗是缓解RA病情进展、改善预后的关键。目前临床上诊断RA主要依靠临床表现及影像学检查，缺乏灵敏度及特异度高的实验室指标[2]。外泌体按照大小可以分为三类：外泌体(直径20～150 nm)、微囊泡(直径100～1 000 nm)及凋亡小体(直径>500 nm)，含有蛋白质、脂质、微小RNA(microRNA，miR)、环状RNA等多种物质，可参与多种生物学过程[3]。其中miR是一类长度为20～24个核苷酸的RNA，可靶向调控下游基因，影响各种病理生理过程，进而参与多种疾病的发生发展[4]。miR在外泌体中稳定存在，可以随着体循环被远处或邻近细胞所摄取，在多种疾病的诊断及病情评估中有重要价值，例如癌症[5]、糖尿病[6]和神经退行性疾病[7]等。研究发现，外周血外泌体源性miR(exomiR)对RA的早期诊断有一定价值[8]。miR-24-3p、 miR-125a-5p和miR-144-3p既往已经被报道在RA关节液、滑膜组织及滑膜成纤维细胞中异常表达[9-11]。外周血外泌体中miR-24-3p、 miR-125a-5p和miR-144-3p的检测及其意义既往未见报道。本研究检测RA患者血清exomiR-24-3p、 exomiR-125a-5p和exomiR-144-3p表达，旨在寻找RA的早期诊断标志物，为临床提供参考。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2020年12月至2022年1月本院收治的RA患者124例(RA组)，其中男52例，女72例；年龄38～72岁，平均(54.19±3.25)岁；BMI为(21.56±2.19)kg/m2。另选取同期本院健康体检中心收取的健康体检者100例(对照组)，其中男41例，女59例；年龄35～65岁，平均(53.11±4.01)岁；BMI为(22.03±2.31)kg/m2。2组患者性别、年龄和BMI比较，差异无统计学意义(P>0.05)。RA组患者纳入标准：①RA的诊断符合《2018中国类风湿关节炎诊疗指南》[12]；②年龄≥18岁；③资料完整。排除标准：①肿瘤；②急慢性感染；③免疫缺陷；④代谢性疾病。

1.2 方法

1.2.1 血清外泌体的分离和鉴定 采集受试者肘静脉血，离心后分离血清。用EXOQ5TM-1血清外泌体试剂盒(北京博迈斯科技发展有限公司)提取外泌体，用磷钨酸(北京中镜科仪技术有限公司)对外泌体进行染色。用JEM-2100F透射电子显微镜(上海研酷检测中心)观察颗粒形态。

1.2.2 蛋白印迹法检测外泌体表面标志物TSG101及CD63[13]表达 用外泌体总蛋白提取试剂盒(上海贝博生物科技公司)提取总蛋白，用BCA试剂盒(上海一研生物科技有限公司)检测蛋白浓度，10% SDS-PAGE电泳分离蛋白，用半干转移法将蛋白转至PVDF膜上。随后用5%脱脂奶粉封闭2 h，加入TSG101一抗(1∶10 000)、CD63一抗(1∶1 000)，4 ℃过夜孵育，次日去除一抗，用TBST洗涤3次后加入二抗(1∶1 000)，封闭1 h，抗体均购自美国Sigam公司。采用ECL发光仪进行蛋白成像。

1.2.3 外泌体浓度检测 用英国Nanosight NS300纳米粒度仪检测外泌体颗粒浓度，将样品稀释10 000倍，阈值为5。

1.2.4 实时荧光定量PCR法检测2组exomiR-24-3p、 exomiR-125a-5p和exomiR-144-3p表达水平 用TRIzol法提取总RNA。通过反转录获取cDNA，随后用荧光定量试剂盒(上海宇玫博生物科技有限公司)进行检测，操作步骤按照试剂盒说明书进行，用2-△△Ct法计算miR相对表达量。引物序列：miR-24-3p上游为5’-GGCGATCATACTGGGAGATG-3’，下游为5’-TGTGATTCAAGTTGGGGTCA-3’；miR-125a-5p上游为5’-AGCATAATACAGCAGGCACAGAC-3’，下游为5’-AAAGGTTGTTCTCCACTCTCTCAC-3’；miR-144-3p上游为5’-ACACGTCTTGCCCTCATTATCT-3’ ，下游为5’-ATAACCTTGGGCTTGTCTTTCA-3’。

1.2.5 RA组红细胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate，ESR)和C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)检测 用免疫酶化学发光仪(法国梅里埃公司)检测ESR和CRP，ESR的检测用魏氏法[14]，CRP的检测用免疫比浊法。

1.2.6 病情活动度评分 28个关节疾病活动度评分(disease activity score in 28 joints，DAS28)[15]：2.6分以下为疾病缓解，2.6～3.2分为低活动度；>3.2～5.1分为中度活动度；5.1分以上为高活动度。比较不同活动度RA患者血清exomiR表达水平。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 血清外泌体鉴定

透射显微镜下观察外泌体直径为30～513 nm；Nanosight检测显示，外泌体平均粒径为159.5 nm，总浓度为2.61×1011个颗粒/mL；蛋白印迹法检测到外泌体标志物TSG101及CD63(图1)，说明样品中含有大量外泌体颗粒，且具有外泌体特性。

a：透射电子显微镜观察外泌体(箭头所指为外泌体)；b：Nanosight检测外泌体浓度及粒径分布；c：蛋白印迹法检测外泌体标志物TSG101及CD63图1 血清外泌体鉴定

2.2 2组患者血清exomiR-24-3p、 exomiR-125a-5p和exomiR-144-3p表达水平比较

与对照组比较，RA组患者血清exomiR-24-3p和exomiR-144-3p表达水平较高，而exomiR-125a-5p表达水平较低(P<0.05)，见表1。

表1 2组患者血清exomiR表达水平比较

2.3 血清exomiR-24-3p、 exomiR-125a-5p和exomiR-144-3p诊断RA的价值

ROC曲线分析结果显示，血清exomiR-24-3p、 exomiR-125a-5p和exomiR-144-3p诊断RA的AUC分别为0.703、0.824、0.736，灵敏度分别为94.89%、96.23%、93.01%，特异度分别为75.01%、85.88%、82.14%。三者联合检测诊断RA的AUC为 0.889，灵敏度为97.23%，特异度为90.12%，见图2。

图2 血清exomiR诊断RA的ROC曲线

2.4 血清exomiR-24-3p、 exomiR-125a-5p和exomiR-144-3p与RA疾病活动度的关系

血清exomiR-24-3p、exomiR-144-3p与DAS28、ESR、CRP均呈正相关(P<0.05)；exomiR-125a-5p与DAS28、ESR、CRP均呈负相关(P<0.05)，见表2。单因素分析结果显示，不同疾病活动度RA患者的exomiR-24-3p、 exomiR-125a-5p、exomiR-144-3p表达水平比较，差异均具有统计学意义(P<0.05)，疾病活动度越高，exomiR-24-3p和exomiR-144-3p表达水平越高，而 exomiR-125a-5p表达水平越低，见表3。

表2 血清exomiR与DAS28评分、ESR、CRP的相关性分析(r值)

表3 血清exomiR与疾病活动度的关系

3 讨论

RA是一种慢性炎症性自身免疫性疾病，随着病情进展，可导致关节畸形和功能障碍，因此早期诊断显得尤为重要[1]。当前临床上仍缺乏高灵敏度和特异度的实验室检查指标，主要依靠临床表现及影像学检查，然而部分患者就诊时已出现不可逆的关节损伤[16]。外泌体在RA发生发展中的作用近年来备受关注。外泌体是一种囊泡体，可以由所有细胞分泌，存在于血液、尿液和脑脊液等多种体液组织中[17]。外泌体中含有非常多的生物活性物质，例如蛋白质和非编码RNA等重要的遗传物质，这些物质可以通过循环转移到靶细胞而发挥作用[18]。有研究显示，外泌体可以参与发育、免疫炎症损伤、组织修复等病理生理过程，外泌体来源的淀粉样蛋白、瓜氨酸蛋白、非编码RNA对RA的诊断和治疗有较高的应用价值[19]。

miR是单链非编码RNA，可作用于靶基因，抑制其翻译或者促使其降解，起到转录后基因沉默作用。miR分子较为稳定，并且特异度较高，成为研究RA生物学标志物的热点。miR占所有外泌体的50%以上，exomiR为RA的早期诊断提供了较好的思路[20]。有研究发现，RA患者血浆exomiR-146a-5p、 exomiR-155-5p均高于健康人群，并且RA活动期患者高于稳定期患者[21]。本研究检测了RA患者血清中exomiR-24-3p、 exomiR-125a-5p和exomiR-144-3p表达水平。miR-24-3p是近年来新发现的一种非编码RNA，在骨关节炎[22]和癌症[23]等疾病中异常表达。有研究发现，miR-24-3p与免疫炎症损伤有关，在RA患者血浆中表达水平升高，对RA的诊断有一定价值[24-25]。miR-125a-5p与细胞增殖、分化和凋亡密切相关，参与免疫炎症信号通路的应答，调节免疫细胞分化[26]。有研究显示，RA患者血浆中miR-125a-5p的表达水平降低[25]。miR-144-3p可通过BMP2/PI3K/Akt信号通路促进RA患者软骨损伤[11]。本研究也发现，与对照组比较，RA组患者血清exomiR-24-3p和exomiR-144-3p表达水平较高，而exomiR-125a-5p表达水平较低。提示miR-24-3p、 miR-125a-5p和miR-144-3p可通过调节免疫炎症而影响RA进展。

本研究首次分析了血清exomiR-24-3p、 exomiR-125a-5p和exomiR-144-3p诊断RA的价值，结果显示，血清exomiR-24-3p、 exomiR-125a-5p和exomiR-144-3p诊断RA的AUC分别为0.703、0.824、0.736，灵敏度分别为94.89%、96.23%、93.01%，特异度分别为75.01%、85.88%、82.14%；三者联合检测可将AUC提高至0.889，灵敏度提高至97.23%，特异度提高至90.12%。提示血清exomiR-24-3p、 exomiR-125a-5p和exomiR-144-3p三者联合诊断RA的价值较高。在RA疾病活动度方面，血清exomiR-24-3p、exomiR-144-3p均与DAS28、ESR、CRP呈正相关；exomiR-125a-5p与DAS28、ESR、CRP均呈负相关；且RA疾病活动度越高，exomiR-24-3p和exomiR-144-3p表达水平越高，而 exomiR-125a-5p表达水平越低。提示exomiR-24-3p、 exomiR-125a-5p和exomiR-144-3p对RA的诊断和病情评估有较高价值。

综上所述，RA患者血清中exomiR-24-3p和exomiR-144-3p表达水平较健康人群高，而exomiR-125a-5p表达水平较低；三者联合检测对RA的诊断有较高价值，并且可以评估疾病活动度。然而本研究也存在一些局限性，未检测RA患者治疗前后exomiR表达水平的变化，也未探讨exomiR在RA中的作用机制。未来需要开展体内外研究，分析exomiR影响RA的生物学机制。