白介素-24通过干扰CXCL12/CXCR4轴抑制宫颈癌细胞迁移和侵袭的机制研究
2023-02-18吴海芳张海波黄素静韩一栩海南医学院第二附属医院产科海南海口570311
吴海芳,张海波,黄素静,韩一栩 (海南医学院第二附属医院产科, 海南 海口 570311)
宫颈癌是临床上常见的妇科恶性肿瘤,据流行病学统计,我国宫颈癌发病率居女性生殖系统恶性肿瘤首位,病死率占恶性肿瘤第二位[1-2]。尽管人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)疫苗能有效预防宫颈癌的发生,但多数女性并未接种或接种延迟,导致宫颈癌的发病率居高不下[2-4]。目前,手术切除联合化疗是临床治疗及改善宫颈癌的主要方式,但对于已发生淋巴结转移或远处转移的患者,其生存率及预后仍不理想[5]。因此,积极探究宫颈癌发生发展的分子机制,寻找潜在的治疗靶点具有重要意义。
众所周知,肿瘤的进展及转移是导致患者死亡的主要原因。趋化因子是一类具有招募-趋化作用的细胞因子,主要通过与细胞表面的相应受体结合,定向趋化靶细胞至炎症、感染或损伤部位。近年来,CXCL12/CXCR4轴因其在宫颈癌中的特殊作用引起学者的广泛关注,一方面被认为是HPV感染的辅助因子[6],另一方面CXCL12/CXCR4轴在缺氧时表达显著上调,这预示着其可能与肿瘤的转移、复发及患者生存期缩短具有相关性[6-9]。进一步研究证实,CXCL12/CXCR4轴的高表达与患者的不良预后呈正相关,靶向CXCL12/CXCR4轴能提高宫颈癌患者的治愈率[10]。白介素-24(interleukin-24,IL-24)是一种独特的具有抑瘤作用的细胞因子。内源性IL-24可在多种免疫细胞中表达,而在肿瘤细胞中表达缺失,体内外研究证实IL-24具有广谱的抗肿瘤发生及转移的作用[11-14]。有学者对肺癌与口腔鳞癌进行研究发现,IL-24能够通过靶向CXCL12/CXCR4轴抑制肿瘤细胞的侵袭及转移,但其在宫颈癌中的作用尚未见相关报道[15-16]。因此,我们通过体外筛选高表达CXCR4的Hela细胞进行探究,以期为靶向CXCL12/CXCR4轴的宫颈癌治疗提供新的思路及策略。
1 材料与方法
1.1 材料
正常子宫颈上皮细胞HcerEpic购自美国ATCC;宫颈癌细胞系Hela、Siha、Caski、C-33A购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库;DMEM/HG培养基、青链霉素双抗购自美国Hyclone公司;FBS购自美国Gibco公司;人重组CXCL12、AMD3100购自美国Sigma公司;TRIzol、反转录试剂盒购自美国Invitrogen公司;嘌呤霉素、含0.25%乙二胺四乙酸的胰蛋白酶、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔或兔抗大鼠IgG购自武汉博士的生物科技公司;兔抗CXCR4单克隆抗体购自美国Santa CruZ公司;大鼠抗Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR单克隆抗体购自美国Cell Signaling Technology公司;SYBR Green RT-PCR Master Mix购自北京康为世纪科技公司;RT-PCR引物由上海生工合成;携带绿色荧光的过表达IL-24慢病毒(LV-IL-24)和阴性对照慢病毒(LV-NC)由上海吉凯生物技术有限公司构建;BCA蛋白定量试剂盒购自英国Proteintech生物公司;Transwell小室(8 μm) 购自美国Millpore公司;酶标仪、PCR仪、RT-PCR仪购自美国Bio-Rad公司;CO2细胞培养箱购自美国Thermo公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养、感染及分组 正常子宫颈上皮细胞HcerEpic及宫颈癌细胞系Hela、Siha、Caski、C-33A均培养于含10%FBS与1%双抗的DMEM/HG培养液中,在37 ℃、5%CO2的恒湿细胞培养箱中培养。取生长状态良好的Hela细胞,0.25%含EDTA的胰蛋白酶常规消化后进行细胞计数,调整细胞密度至1×105个/孔,接种至12孔板中。培养12 h后观察细胞生长融合至50%~60%时,更换为含0.8 μg/mL聚凝胺的不含FBS的新鲜培养基,加入稀释后的LV-NC或LV-IL-24慢病毒液(病毒感染复数=15),置于上述条件的培养箱中培养24 h后,去除原培养液,更换为含1 μg/mL嘌呤霉素、10%FBS的DMEM/HG培养基继续培养5 d,以筛选稳定感染的细胞。取感染72 h后的Hela细胞,置于荧光显微镜下观察感染效率。将Hela细胞分为6组,其中Control组细胞正常培养,无任何特殊处理;CXCL12组细胞用100 ng/mL CXCL12处理;CXCL12+LV-NC组细胞感染LV-NC后使用100 ng/mL CXCL12处理;CXCL12+LV-IL-24组细胞感染LV-IL-24后使用100 ng/mL CXCL12处理;CXCL12+AMD3100组细胞参考文献[16]方法处理并联合100 ng/mL CXCL12及1 μg/mL AMD3100处理;CXCL12+AMD3100+LV-IL-24组细胞经LV-IL-24感染后联合100 ng/mL CXCL12与1 μg/mL AMD3100处理。上述各组细胞均置于37 ℃、5%CO2的恒湿细胞培养箱中培养24 h后进行后续相关实验。
1.2.2 实时荧光定量RT-PCR 取生长状态良好的待测细胞,TRIzol法提取细胞中的总RNA,酶标仪检测纯度与质量后,反转录试剂盒进行逆转录合成cDNA,随后参考SYBR Green RT-PCR Master Mix说明书进行实时荧光定量。RT-PCR的反应条件为:95 ℃预变性2 min,95 ℃变性5 s→60 ℃退火30 s→72 ℃延伸15 s,40个循环周期。RT-PCR的引物序列为:CXCR4-F,5’-CCACCATCTACTCCATCATCTTC-3’,CXCR4-R,5’-ACTTGTCCGTCATGCTTCTC-3’;IL-24-F,5’-GCCAA-GCTTATGAATTTTCAACAGAGG-3’,IL-24-R,5’-GCCG-TCGACCTAGAGCTTGTAGAATTT-3’;β-actin-F,5’-AA-ATCTGGCACCACACCTTC-3’,β-actin-R,5’-AGCACA-GCCTGGATAGCAAC-3’。以β-actin为内参,采用2-ΔΔCt法进行分析。实验重复3次。
1.2.3 划痕实验 取生长状态良好的各组细胞,常规消化后调整细胞密度至2×105个/孔并接种至背面划有相距约5 mm的平行水平线的6孔板中,培养24 h后待单层细胞生长融合至80%左右时,用10 μL的移液器枪头尖端垂直于平行线在培养皿的底部划2条平行线,轻轻擦去平行线内部细胞,PBS冲洗2次后,按1.2.1项下方法进行分组处理,并更换为相应的不含FBS的培养基,置于培养箱中继续培养24 h,观察细胞的迁移状况。
1.2.4 Transwell侵袭实验 取生长状态良好的感染LV-NC、LV-IL-24或正常未感染的Hela细胞,调整细胞密度至5×104个/孔并接种至基质胶包被的Transwell小室,按1.2.1项下方法将下室更换为含10%FBS的不同条件的培养液,共800 μL,置于细胞培养箱中培养24 h后,取出小室,湿棉签擦拭小室上层未穿出细胞,无水乙醇固定后,0.1%的结晶紫进行染色,PBS冲洗后,倒置显微镜下观察穿出细胞数,每组随机选取5个视野进行计数。实验重复3次。
1.2.5 Western blot检测蛋白表达 取待测细胞,使用RIPA裂解液提取细胞中总蛋白,按照BCA蛋白定量试剂盒说明书检测蛋白浓度后,取加热变性的蛋白约40 μg在10%的SDS-PAGE凝胶上于80 V恒压下电泳分离不同蛋白条带,随后在电流为130 mA、电压为20 V的条件下将分离后的蛋白条带采用湿转法转移至PVDF膜上,5%的脱脂奶粉进行抗体封闭后,加入一抗CXCR4(1∶800)、Akt(1∶800)、p-Akt(1∶500)、p-mTOR(1∶500)、mTOR(1∶800)、β-actin(1∶2 000),4 ℃孵育过夜后,加入辣根过氧化物酶标记的相应二抗(1∶5 000)并于室温下孵育2 h,滴加发光液进行曝光拍照。Image J软件测定条带灰度值,以待测蛋白与内参β-actin的比值作为其相对表达量。实验重复3次。
1.3 统计学分析
2 结果
2.1 CXCR4在宫颈癌细胞系中的表达
RT-PCR与Western blot实验结果显示,与正常子宫颈上皮细胞HcerEpic相比,宫颈癌细胞系Hela、Siha、Caski、C-33A中CXCR4的mRNA及蛋白表达水平均显著增加(P<0.05),其在Hela细胞中的表达最为显著(P<0.01),因此选用Hela细胞进行后续相关实验,见图1。
a:RT-PCR检测宫颈癌细胞系中CXCR4 mRNA表达;b:Western blot检测宫颈癌细胞系中CXCR4蛋白表达 *:与HcerEpic相比,P<0.05;#:与HcerEpic相比,P<0.01图1 CXCR4在宫颈癌细胞系中的表达
2.2 慢病毒感染后Hela细胞中IL-24的表达
免疫荧光结果显示,与Control组相比,转染LV-NC与LV-IL-24慢病毒的细胞中可见明显绿色荧光;RT-PCR实验结果显示,与Control组相比,转染LV-IL-24的细胞中IL-24 mRNA表达水平显著增加(P<0.01),而转染LV-NC的细胞中IL-24 mRNA无明显变化(P>0.05),见图2。
a:免疫荧光观察宫颈癌细胞中慢病毒感染效率(×100);b:RT-PCR检测宫颈癌细胞中IL-24的mRNA表达 #:与Control组相比,P<0.01图2 宫颈癌细胞中慢病毒感染效率验证
2.3 过表达IL-24对CXCL12介导的宫颈癌细胞迁移能力的影响
划痕实验结果显示,与Control组相比,CXCL12组与CXCL12+LV-NC组细胞的迁移率显著增加(P<0.05),而CXCL12+LV-IL-24组、CXCL12+AMD3100组及CXCL12+LV-IL-24+AMD3100组细胞的迁移率均明显降低(P<0.05),其中以CXCL12+LV-IL-24+AMD3100组最为显著(P<0.01);与CXCL12组相比,CXCL12+LV-IL-24组、CXCL12+AMD3100组及CXCL12+LV-IL-24+AMD3100组细胞迁移率均明显降低(P<0.01),CXCL12+LV-NC组无明显变化(P>0.05),见图3。
*:与Control组相比,P<0.05;#:与Control组相比,P<0.01;△:与CXCL12组相比,P<0.01图3 划痕实验检测各组宫颈癌细胞的迁移能力
2.4 过表达IL-24对CXCL12介导的宫颈癌细胞侵袭能力的影响
Transwell实验结果显示,与Control组相比,CXCL12组与CXCL12+LV-NC组侵袭细胞数显著增加(P<0.05),而CXCL12+LV-IL-24组、CXCL12+AMD3100组及CXCL12+LV-IL-24+AMD3100组侵袭细胞数显著减少(P<0.05),且以CXCL12+LV-IL-24+AMD3100组最为明显(P<0.01);与CXCL12组相比,CXCL12+LV-IL-24组、CXCL12+AMD3100组及CXCL12+LV-IL-24+AMD3100组侵袭细胞数均明显减少(P<0.05),CXCL12+LV-NC组无明显变化(P>0.05),见图4。
a:Transwell实验检测宫颈癌细胞的侵袭能力(×100);b:侵袭细胞数定量图 *:与Control组相比,P<0.05;#:与Control组相比,P<0.01;△:与CXCL12组相比,P<0.05图4 Transwell实验检测各组宫颈癌细胞的侵袭能力
2.5 过表达IL-24对CXCL12介导的宫颈癌细胞中Akt/mTOR途径表达的影响
Western blot检测结果显示,与Control组相比,CXCL12组、CXCL12+LV-NC组细胞中CXCR4、p-Akt和p-mTOR蛋白表达水平均显著增加(P<0.05),CXCL12+AMD3100组和CXCL12+LV-IL-24+AMD3100组细胞中CXCR4、p-Akt、p-mTOR蛋白表达水平均明显降低(P<0.05),CXCL12+LV-IL-24组中CXCR4蛋白表达无明显变化(P>0.05),但p-Akt、p-mTOR蛋白表达水平均明显降低(P<0.05)。与CXCL12组相比,CXCL12+LV-IL-24组、CXCL12+AMD3100组和CXCL12+LV-IL-24+AMD3100组细胞中CXCR4、p-Akt、p-mTOR蛋白表达水平均显著降低(P<0.05),见图5。
a:Western blot检测CXCR4及Akt/mTOR信号通路中相关蛋白表达;b~d:各蛋白定量图 *:与Control组相比,P<0.05;△:与CXCL12组相比,P<0.05;▲:与CXCL12组相比,P<0.01图5 各组细胞中的CXCR4、p-Akt与p-mTOR蛋白表达
3 讨论
CXCR4是位于细胞膜上的七次跨膜G蛋白偶联受体家族成员之一,而G蛋白偶联受体是最为常用的药物靶标[17]。CXCR4信号通路在胚胎的发育、组织修复、骨髓造血和免疫监控等正常生理过程中起关键作用[18]。而在肿瘤中,有研究报道CXCR4能够直接促进多种癌细胞的形成、增殖和转移等多个过程[19-20]。在小鼠体内,中和CXCL12/CXCR4的相互作用可显著抑制乳腺癌细胞向局部淋巴结和肺的转移[21]。同时,位于细胞膜表面的CXCR4在CXCL12作用下发生内化,不仅促进细胞表面CXCR4受体的表达,还放大了上游信号,通过刺激胞内钙离子的释放,进而激活ERK、Akt/mTOR信号通路及腺苷环化酶和环磷酸腺苷,而上述信号途径的活化能够直接诱导细胞增殖、存活及蛋白合成,导致肿瘤的发生和转移[22-23]。
AMD3100是美国食品药品监督管理局批准上市的CXCR4抑制剂,其能够有效破坏CXCL12/CXCR4轴而发挥抗癌作用[24]。有研究证实,外源重组CXCL12可通过CXCR4诱导Hela等多种宫颈癌细胞的迁移、侵袭行为[25]。故本研究首先筛选出高表达CXCR4的宫颈癌Hela细胞,并对其进行探究,结果表明,外源性CXCL12能够显著促宫颈癌细胞的迁移与侵袭,还能通过促进p-Akt和p-mTOR蛋白的表达,激活Akt/mTOR信号通路;而应用AMD3100能够有效阻断上述途径,抑制CXCL12/CXCR4对宫颈癌细胞侵袭与迁移的促进作用。
IL-24又称为黑色瘤分化相关基因-7(melanoma differentiation associated gene-7,MDA-7),属于IL-10基因家族的一种分泌型细胞因子[11]。尽管IL-24早在十几年前就已经被发现,但其在病理生理中的具体作用直到近年来才逐渐明确。研究证实,IL-24不仅参与正常的免疫过程,其同样在人类其他多种疾病中发挥重要的作用。IL-24对于黑色素瘤、前列腺癌、肺癌、胶质瘤等多种肿瘤具有抑制作用,此外,IL-24还能够调控自身免疫系统疾病与炎症感染[12,14,26]。进一步的分子机制研究表明,IL-24不仅能够抑制肿瘤干细胞增殖,降低干细胞的自我更新能力,还能诱导其凋亡。此外,IL-24还能直接作用于调控细胞增殖、侵袭与转移的信号通路,如在乳腺癌中,过表达IL-24能够通过抑制Wnt/β-catenin和PI3K/Akt/mTOR等信号通路,抑制裸鼠皮下移植瘤的生长[27]。通过反向蛋白阵列分析野生型与突变型的IL-24肺癌细胞裂解物发现,Akt/mTOR信号通路的相关蛋白表达水平呈现的差异最为显著,且IL-24的突变显著降低了p-Akt和p-mTOR的表达[28]。在宫颈癌中,Shi等[29]研究发现,过表达IL-24能够通过下调MMP-2的表达,上调p38丝裂原活化蛋白激酶,从而在体外抑制宫颈癌细胞Caski的迁移与侵袭。还有研究显示,联合应用IL-24可能通过降低血管生长因子及其受体与血小板源性生长因子-B的表达,从而降低裸鼠宫颈癌移植瘤的微血管密度,增强肿瘤对顺铂的化疗敏感性[30]。这说明IL-24对抑制宫颈癌的进展及改善其治疗效果具有极大的应用前景。有研究发现,单独使用AMD3100控制肿瘤转移的临床疗效欠佳,联合应用IL-24与AMD3100可能是更好地控制肿瘤进展的有效策略[31]。在肺癌与口腔鳞状细胞癌中的研究均证实,过表达IL-24能够明显抑制CXCL12/CXCR4轴对肿瘤细胞的增殖、侵袭的促进作用,进一步研究发现,IL-24可能在转录后水平抑制CXCR4的表达[14-15]。本课题组发现过表达IL-24同样能够抑制CXCL12/CXCR4轴介导的宫颈癌细胞迁移、侵袭与转移,且联合AMD3100的作用最为显著,其机制可能为下调p-Akt和p-mTOR的表达,从而抑制Akt/mTOR等信号通路的激活;此外,本研究还观察到过表达IL-24能抑制CXCL12对Hela细胞中CXCR4表达的促进作用。这说明联合使用IL-24能更好促进AMD3100对宫颈癌细胞迁移与侵袭的抑制作用,而这可能是通过CXCL12/CXCR4轴发挥作用。
综上,过表达IL-24能够通过Akt/mTOR信号途径抑制CXCL12/CXCR4轴诱导的宫颈癌细胞的侵袭与迁移行为,且联合应用CXCR4抑制剂AMD3100的效果更为显著。本研究结果为进一步探究IL-24结合CXCL12/CXCR4对宫颈癌靶向治疗提供了新的思路及策略。