高效液相色谱联用四极杆轨道阱质谱分析柏树花粉过敏原蛋白

宋天园，道吉吉，夏建珍，王甜，肖兰，崔箭，唐丽※

[1.民族医药教育部重点实验室（中央民族大学），北京 100081；2.中央民族大学药学院，北京 100081；3.中央民族大学附属校医院，北京 100081；4.北京协和医学院护理学院，北京 100144]

柏科植物在我国有8属29种，是传统园林绿化树种，其中以圆柏（Juniperus chinensis L.）最为常见，广泛分布于全国（中国生物物种名录2022版），同时柏树花粉也是引发季节性过敏性鼻炎和哮喘等过敏性疾病主要诱因之一[1,2]。随着生态绿化水平的提高和圆柏等柏科植物的广泛应用，我国各地空气中的柏树花粉浓度也呈现较高的水平和很强的季节性特点。研究显示，我国多个地区和城市的空气监测中均报告含量较高的柏树花粉[3-6]，尤其是在春季花粉季节，有的地区大气中漂浮的柏树花粉浓度可高达294 g/m3[3]。同时在临床也相应出现了大量的花粉过敏患者并且呈现出逐年增长的趋势[7-9]，尤其在一些以圆柏或柏树绿化树种占比较大的小区或绿地，周边居民或人群往往在每年的3月中下旬至4月中旬期间集中高发季节性过敏性鼻炎和/或过敏性哮喘等疾病。临床常见的症状表现主要有持续性的喷嚏和流涕不止、鼻腔堵塞甚至影响呼吸、眼睛分泌物增多和红肿奇痒等，严重过敏患者出现哮喘、憋闷、听力下降及视物昏花等症状，还有些过敏患者会出现皮肤瘙痒、红肿等皮疹皮炎症状。

近年来，柏树花粉过敏性疾病的流行病学、花粉变应原及致敏性评价、致敏机制等方面的研究越来越引起国内外学者的广泛关注。在欧洲，法国和西班牙等国家的研究显示柏树花粉是冬春季节花粉症的重要变应原[10,11]。我国学者也对柏树花粉致敏开展了一些研究工作[12-15]。柏树花粉变应原蛋白是其引发过敏反应的关键基础，因而获得纯度高的柏树花粉变应原蛋白可为其结构及表位、生物学特性、致敏性评价和检测方法等方面的研究提供必要的材料。本实验对柏树花粉进行蛋白提取，应用LS-MS/MS方法对蛋白提取物进行蛋白质组学分析，鉴定其中主要致敏蛋白，为进一步开展柏树花粉致敏蛋白的分离与鉴定、致敏性评价及相关检测方法的开发与建立提供思路和参考。

1 材料与仪器

1.1 材料与试剂

圆柏花粉，2022年4月柏树花粉释放盛期于中央民族大学校内采集，得到的花粉低温干燥后4℃保存。

二硫苏糖醇（DTT）、碘乙酰胺、碳酸氢铵、胰蛋白酶（测序级）和磷酸盐缓冲溶液（PBS，Sigma），甲醇、乙腈和甲酸为色谱级和质谱级（Merck KGaA），盐酸为优级纯（Merck KGaA），蒸馏水（屈臣氏），3 kD超滤管（PALL），SCX tip（Thermo）。

1.2 仪器

花粉采集器（中国西安必胜电子科技有限公司），高效液相色谱系统（北京普源精电科技有限公司RIGOL L-3000），高分辨质谱仪（美国Thermo公司Q Exactive HF-X），真空离心浓缩仪（北京吉艾母科技有限公司CV100-DNA），涡旋振荡器（SCILOGEX MX-S），离心机（Eppendorf，5804 R），酶标仪（DR200B），超声破碎仪（上海沪析实业有限公司JY96-IIN），电热恒温水浴锅（北京市光明医疗仪器有限公司XMTD-7000），KQ-500E型超声波清洗器（中国昆山市超声仪器有限公司）。

2 方法

2.1 花粉的采集和前处理

采用自然脱落法和使用花粉采集器，将采集到的圆柏花序和用花粉采集器采集到的花粉进行筛分去除杂质，低温烘干后于4℃保存。

2.2 花粉粗蛋白浸液制备

去除杂质后收集到的干燥花粉按重量体积比1:20加入0.01 mol/L的PBS液，冰浴超声波破碎15 min，再将所得花粉混悬液于4℃下连续搅拌24 h，然后于4℃、10 000 g下离心20 min，取上清液。将上清液用0.45m的滤器过滤，4℃保存[15,16]。

2.3 花粉蛋白提取富集

将上述得到的滤液用PALL 3 kD超滤管进行浓缩，4℃下4 500 g离心，得到超滤后的超滤浓缩液，4℃保存。

2.4 酶解

取适量蛋白加入终浓度为5 mM DTT，37℃孵育1 h，然后恢复室温。加入终浓度为10 mM的碘乙酰胺，室温避光孵育45 min。用25 mM碳酸氢铵将样本稀释4倍并按照蛋白和胰酶比例50:1加入胰酶进行溶液酶切，37℃孵育过夜；第2天加入甲酸调节pH小于3，终止酶切。

2.5 脱盐与纯化

使用C18脱盐柱对样本进行脱盐处理，100%乙腈活化脱盐柱，0.1%甲酸平衡柱体，加载样本到柱上，使用0.1%甲酸洗涤杂质，再以70%乙腈洗脱，收集洗脱液；将洗脱液经SCX-tip处理得到纯化的样品[17]，冷冻干燥后于20℃保存。

2.6 色谱条件

将冻干的酶解样品用0.1%（V/V）甲酸溶液复溶至0.4g/L，取20L进行液相色谱-质谱联用分析，重复3次。

RIGOL L-3000 LC，ReproSil-Pur C18-AQ色谱柱（1.9m，1.5 mm 250 mm），流动相A水（0.1%甲酸），B乙腈（0.1%甲酸）梯度洗脱，程序为0~5 min，8% B；5~35 min，12%B；35~44 min，30%B；44~45 min，40%B；45~59 min，95%B；59~60 min，99%B。流速：0.6 mL/min；柱温：40℃；进样量5L。

2.7 质谱条件

Q Exactive HF-X高分辨质谱仪，Nanospray FlexTM（NSI）离子源；离子传输管温度275℃，鞘气（N2）流速40 L/min，辅助气（N2）流速10 L/min；离子喷雾电压2.4 kV，透镜电压50 V；正离子扫描模式。应用Full MS/dd-MS2模式，质谱全扫描范围为m/z 350~1 500，一级质谱全扫描分辨率设为120 000（200 m/z），C-trap最大注入时间为80 ms，AGC target为3 106；选取全扫描中离子强度TOPN=40的母离子使用高能碰撞裂解（HCD）方法碎裂，二级子离子全扫描分辨率设为15000（200m/z），AGC为5 104，最大注入时间为45ms，二级最低阈值104；Peptidematch打开；顶点激发，2~8s，肽段碎裂碰撞能量NEC/step设为27，生成质谱检测原始数据（.raw）。仪器每7 d采用Pierce LTQ Velos ESI正离子校正溶液（美国Thermo公司）进行质量数校正。

2.8 数据采集分析与验证

植物花粉蛋白的序列数据来自数据库网站（Uniprot蛋白数据库，Universal Protein，https://www.uniprot.org/），并下载为Fasta文件。将采集的肽质量图谱（PMF）和二级质谱（MS/MS）数据信息通过导入Proteome Discover 2.4软件（美国Thermo公司）进行搜索和计算匹配，检索引擎为Sequest HT，参数设置为：最大漏切位点数2，肽段范围5~120，母离子容差10-5，碎片离子容差0.02 Da，y和b离子权重均为1，鉴定得到肽段的置信度＞95%；Sequest HT评分值采用其搜索算法对蛋白匹配度打分，分值越高可信度越高。在SDAP蛋白数据库（Structural Database of Allergenic Proteins，https://fermi.utmb.edu/SDAP/sdap_src.html） 中检索匹配相关蛋白质，并提取匹配的蛋白质和肽段相关信息。验证方法采用平行反应监测（PRM）模式，靶向筛查肽段覆盖率和Sequest HT评分排名靠前的蛋白质，完成确证鉴定。

3 结果与讨论

3.1 主要过敏原蛋白及肽段的鉴定

圆柏花粉蛋白提取物经胰蛋白酶进行溶液酶切处理后，其产物经LC-MS/MS分析，总离子流色谱图见图1，其中谱峰峰型良好，谱图重现性好，数据采集稳定。以Sequest HT为搜索引擎，在SDAP蛋白质数据库中，以PMF结合MS/MS模式搜库，可匹配到37种花粉蛋白，见表1。

图1 圆柏花粉蛋白酶酶解产物总离子流色谱图Fig.1 Total ion flow chromatography of protease hydrolysates from J.chinensis pollen

表1 圆柏花粉蛋白酶解产物中的蛋白质鉴定Table 1 Protein identification for protease hydrolysates from J.chinensis pollen

经HPLC-MS/MS分析得到的肽段序列数据在SDAP蛋白数据库中检索匹配和比对，得到蛋白质鉴定信息（表2），包括蛋白质的序列号、理论分子量、等电点以及蛋白质名称和来源物种名称。鉴定的37个蛋白质理论分子量范围为13.1~105 kD，其来源包括圆柏Juniperus chinensis L.、刺柏Juniperus formosana Hayata、侧柏Platycladus orientalis（L.）Franco和日本柳杉Cryptomeria japonica D.Don等。

表2 蛋白质鉴定结果Table 2 Protein identification results

3.2 与柏科花粉变应原一致的肽段

到目前，Uniprot蛋白数据库（Universal Protein）中收录的柏科花粉变应原蛋白有10种，分子量约在40 kD左右，均具有较强的变应原性和致敏作用，依据其活性可分为两组。其中1组发现了7种，均具有果胶裂解酶活性，包括Cha o 1、Cry j 1、Cup a1、Cup s 1、Jun a 1、Jun s 1和Jun v 1；2组发现了3种，一般具有聚半乳糖醛酸酶活性，包括Cha o 2、Cry j 2和Jun a 2[18,19]。本实验筛选出了3种蛋白（Q93X51、A0A808QQB8和A0A7R6H3R2）可满足相关鉴定确证需求，即序列之间具有较高的相似性，可提取出具备典型特征的肽段，且具有较高的响应，3种蛋白的特征肽段图谱见图2。本实验对圆柏花粉蛋白酶解产物的蛋白组学分析鉴定结果表明，圆柏花粉中含有分别与柏科花粉1组和2组变应原一致的肽段，序列一致的肽段、分子量及其一致性情况见表3。

表3 与柏科花粉1组和2组变应原一致的肽段Table 3 Peptide segments consistent with allergens of Cupressaceae pollen

图2 3种蛋白（Q93X51、A0A808QQB8、A0A7R6H3R2）的特征肽段图谱Fig.2 Characteristic peptide chromatography of three proteins Q93X51,A0A808QQB8 and A0A7R6H3R2

3.3 讨论

除了表3中的序列相似肽段之外，本实验对圆柏花粉蛋白酶解后的质谱分析也得到了其他肽段，这些肽段的序列与其他科属植物蛋白的序列存在一定的相似性，其来源有可能是圆柏花粉变应原蛋白经酶解后生成的一些肽段，也属于柏科花粉变应原蛋白序列，也有可能来源于非变应原蛋白的酶解肽段，在分子量上接近。已有的变应原分析研究文献表明[19,20]，如果肽段序列之间的相似性超过30%，则提示其很有可能同源，当一个肽段的氨基酸序列与某个特定的变应原序列一致性大于50%时，则表明二者可能共享变应原表位或者具有交叉反应。本实验的蛋白组分析表明这些肽段与其他科属植物的蛋白序列存在较高的相似性，也从一定程度解释了花粉变应原之间以及花粉与其他植物性变应原之间存在着广泛的交叉过敏反应。

4 结论

本研究建立的HPLC-MS/MS分析检测方法通过PMF+MS/MS搜索结合计算匹配，以及PRM模式的确证分析，鉴定了圆柏花粉中的3个过敏原蛋白，确证了圆柏花粉中含有1组和2组变应原蛋白。该方法可用于对溶液酶切法获得的圆柏花粉蛋白肽段进行分析鉴定，为高效精准检测鉴定花粉过敏原蛋白及其致敏性评价提供有效技术支持。本实验结果可为花粉变应原的分析检测提供参考，为开发高效的花粉变应原检测技术、变应原预测及其潜在致敏风险评价提供参考和依据。