响应面优化超声微波辅助提取千里香总黄酮工艺及其抗氧化活性研究

徐汉，张乔，王宝庆

（哈尔滨商业大学药学院，黑龙江省 哈尔滨市 150076）

千里香[Murraya paniculata(L.)Jack]属双子叶植物芸香科（Rutaceae）九里香属植物，产于台湾、福建、海南等我国东南部省份[1]。始载于《岭南采药录》，以干燥的叶及枝入药，味辛、微苦，性温，具小毒[2]。《广西中药志》[3]记述千里香具有“行气止痛，活血散瘀，治跌打肿痛、风湿、气痛”等功效，《生草药性备要》[4]指其常用功效是消肿止痛，散瘀活血。主要的活性成分是黄酮类[5-7]、香豆素类[8]、挥发油[9]、萜类[10]、多糖[11]和吲哚生物碱[12]类。具有调节血糖[13]、抗炎[14]、抗菌[15]、抗肿瘤[16]、抗氧化[17]和抗焦虑[18]等药理作用。目前，越来越多天然的活性成分被应用到各个领域中。研究表明千里香具有丰富的天然活性成分，值得对其进行更加全面地研究、开发及利用。

煎煮法、蒸馏法和连续回流提取法等传统黄酮类化合物提取方法存在许多缺点，如提取效率低、提取纯度低、提取时间长和浪费提取溶剂等[19]。超声提取的主要理论依据是超声的空化效应、热效应和机械作用，而且超声提取具有提取效率高、时间短、适应性广、提取的药液杂质少、有效成分易于分离和纯化、简单易行及设备维护保养方便等优点[20]。微波提取法具有试剂用量少、节能、污染小、加热均匀易控制、选择性良好、萃取效率高及回收率高等优点[21]。超声波-微波联合辅助提取法同时将两者的优点结合在一起，充分发挥两者各自的优势，提高黄酮类化合物的提取得率[22]。查阅千里香相关文献发现国内目前就其总黄酮提取工艺及抗氧化活性方面的报道较少，缺乏关键性实验研究，本文意在为千里香总黄酮的有效开发利用提供参考。因此本试验采用超声波微波辅助提取千里香总黄酮，通过响应面分析试验，得到千里香总黄酮最佳提取工艺。并对实验得到的千里香总黄酮进行体外抗氧化实验，以期为千里香在各个领域中的进一步开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

千里香[哈尔滨市道外区三棵树中药材大市场，经哈尔滨商业大学金哲雄教授鉴定为Murraya paniculata(L.)Jack]；芦丁对照品（上海源叶生物科技有限公司，纯度＞98%）；Vc对照品（默沙克生物，纯度＞98%）；DPPH（默沙克生物，纯度＞98%）；氯化铝、乙醇、硫酸亚铁、过氧化氢、水杨酸（国产分析纯，上海德榜化工有限公司）。

CW-2000超声微波协同萃取仪（上海精密仪器仪表有限公司）；JC-UT2000紫外可见分光光度计（聚创环保集团）；N-1000旋转蒸发仪（广州艾欣科学仪器有限公司）；循环水真空泵SHB-95（河南秋佐仪器设备有限公司）；3K30低温离心机（上海基汇生物科技有限公司）；BS423S电子天平（深圳市新朗普电子科技有限公司）；JY-04A多功能粉碎机（鹤壁市丰源实验仪器制造有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 样品预处理及总黄酮提取流程千里香洗净，35℃烘干，粉碎过60目筛，保存备用。称量样品，设置超声波功率和微波功率，将样品加入萃取器进行萃取，离心分离，取上清液，冷冻干燥，得总黄酮。

1.2.2 总黄酮含量测定方法

1.2.2.1 标准溶液的配置精密称定芦丁标准品10.00 mg于容量瓶，并加入90%的乙醇至100 mL，待用。

1.2.2.2 标准曲线的绘制精密称取标准液0 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL于25 mL容量瓶，再分别加入1 mL 1%的AlCl3溶液[23]，定容（90%乙醇）至刻度摇匀。使用紫外可见分光光度计在410 nm波长处测定3次，取均值。以标准品浓度x（mg/mL）为横坐标，吸光度y为纵坐标，绘制标准曲线。在浓度范围0~0.024 mg/mL的回归方程是y=15.642 x-0.083 6，R2=0.999 3。可用于千里香总黄酮质量浓度的测定。

取样品溶液，根据上述方法测定吸光度值，通过回归方程计算出千里香总黄酮质量浓度c，提取率按以下公式计算[24]。

式中：c表示根据标准曲线计算出千里香总黄酮质量浓度（mg/mL）；V为样品液的体积（mL）；Q为稀释倍数；M为千里香粉末的质量（mg）。

1.2.2.3 精密度试验、重复性、稳定性和加样回收率试验称取芦丁标准品1.0 g，共6份，按“1.2.2.2”方法制备供试品溶液并测定吸光度，测得RSD为0.62%，表明该仪器精密度良好。

称取样品粉末1.0 g，共6份，按“1.2.2.2”方法制备供试品溶液并测定吸光度，测得RSD为1.6%，表明该方法重复性良好。

称取样品粉末1.0 g，按“1.2.2.2”方法制备供试品溶液，每隔10 min测定吸光度1次，持续60 min，测得RSD为2.3%，表明该方法在1 h内稳定性良好。

称取样品粉末1.0 g，共6份，每份加入芦丁对照品适量，按“1.2.2.2”方法制备供试品溶液并测定吸光度，按公式计算得到平均回收率为98.6%，RSD为1.4%，表明该方法准确度良好。

回收率%=（实验测得量－实验前样品含量）/加入对照品含量100%

1.2.3 响应面提取优化工艺试验

1.2.3.1 提取工艺试验以千里香总黄酮得率作为参照标准，分别对其料液比、超声波功率和微波功率进行筛选，以确定最佳提取条件。

以千里香粉末和90%乙醇提取液按1:10、1:20、1:30、1:40、1:50（g/mL）的比例加入超声微波辅助萃取仪中，设置萃取条件为超声功率、微波功率和提取时间分别为300 W、300 W和30 min，进行试验。

以千里香粉末和90%乙醇提取液按1:30（g/mL）的比例于超声微波辅助萃取仪中，设置超声功率条件为（100 W、200 W、300 W、400 W、500 W），微波功率和提取时间条件分别为300 W和30 min，进行试验。

以千里香粉末和90%乙醇提取液按1:30（g/mL）的比例于超声微波辅助萃取仪中，设置微波功率条件为（100 W、200 W、300 W、400 W、500 W），超声功率和提取时间条件分别为300 W和30 min，进行试验。

1.2.3.2 响应面试验以单因素实验数据为参考，选择料液比（A），超声功率（B），微波功率（C）3个要素为自变量，以千里香总黄酮得率（Y）为响应值，利用响应面法对提取条件进行优化，用Design-Expert 8.0.6软件进行数据拟合和结果分析，试验因素与水平见表1。

表1 因素与水平表Table 1 Factor and level table

1.2.3.3 提取时间的优化以响应面优化得到的提取工艺条件为基础，设置提取时间为10 min、20 min、30 min、40 min、50 min进行试验，以总黄酮得率为指标，对千里香总黄酮最佳提取时间进行优化。

1.2.4 千里香总黄酮体外抗氧化活性测定

1.2.4.1 对DPPH自由基的清除作用配置浓度分别为0.05 mg/mL、0.10 mg/mL、0.15 mg/mL、0.20 mg/mL、0.25mg/mL、0.30mg/mL的千里香总黄酮溶液各2mL，向其中分别加入浓度为0.2 mmol/L的DPPH溶液2 mL，暗处静置，充分反应30 min，于517 nm处测定吸光度为Ai；相同条件方法下用无水乙醇代替DPPH，测得吸光度为Aj；相同条件方法下用蒸馏水代替样品溶液，测得吸光度为Ao。

同等条件方法下用Vc标准品作为对照[25]。

DPPH自由基清除率=[1(AiAj）/Ao]100%

1.2.4.2 对羟自由基的清除作用配置浓度分别为0.05 mg/mL、0.10 mg/mL、0.15 mg/mL、0.20 mg/mL、0.25mg/mL、0.30mg/mL的千里香总黄酮溶液各1mL，向其中分别加入浓度为8 mmol/L的FeSO4溶液、C7H6O3-C2H6O溶液、H2O2溶液混合溶液1 mL，充分反应，静置1 h。于517 nm处测定其吸光度为Az；相同条件方法下用蒸馏水代替样品溶液，测得吸光度为Ax；同时将H2O2替换，测得的吸光度为Ay；相同条件方法用Vc标准品作为对照[26]。

羟自由基清除率=[1(AzAy）/Ax]100%。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果与讨论

2.1.1 料液比的筛选

由图1所示，千里香总黄酮得率随着料液比的增大呈现先上升后略有下降的趋势，当料液比为1:30 g/mL时，千里香总黄酮得率达到峰值；当料液比在1:30~1:50 g/mL时，千里香总黄酮得率略有下降。这可能是由于提取时间的推移杂质成分逐渐析出而影响到黄酮成分的析出，而且超声时间越长，细胞破碎的越完全，可能会使某些黄酮类成分发生氧化，缩合等反应而导致总黄酮的得率降低[27]，所以选择料液比条件为1:30。

图1 料液比对千里香总黄酮得率的影响Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on the rate of total flavonoids in Murraya paniculata(L.)Jack

2.1.2 超声功率的筛选

由图2所示，千里香总黄酮得率在0~300 W的范围内随超声功率的变大而升高，并在300 W时到达峰值。当超声波功率超过300 W后，千里香总黄酮得率逐渐降低。可能是因为超声波具有较强的机械剪切作用，长时间作用会使总黄酮结构破坏，导致总黄酮的得率下降。另外长时间作用导致细胞壁破裂造成细胞内的杂质成分更易于溶出，这也可能是总黄酮得率下降的原因[28]。所以选择超声波功率为300 W。

图2 超声功率对千里香总黄酮得取率的影响Fig.2 The effect of ultrasonic power on the rate of total flavonoids in Murraya paniculata(L.)Jack

2.1.3 微波功率的筛选

由图3所示，在100~400 W范围内千里香总黄酮得率随微波功率的增大而增大，在超过400 W后，千里香总黄酮的得率明显降低。可能是由于微波强烈的穿透力，微波的穿透力随着微波功率的提高而不断增强，在一定范围内会导致细胞壁的破裂，细胞内的有效成分更易溶出，使千里香总黄酮得率增加。然而过高的功率和过强的穿透力也会加速千里香中其他成分的析出，而且功率过高还会使料液比发生变化而影响千里香总黄酮的得率[22]。所以微波功率选择400 W。

图3 微波功率对千里香总黄酮得率的影响Fig.3 The effect of microwave power on the rate of total flavonoids in Murraya paniculata(L.)Jack

2.2 响应面法优化结果

根据响应面实验得到的试验结果见表2，方差分析结果见表3。

表2 响应面实验设计方案及结果Table 2 Response surface experiment design and results

表3 方差分析结果Table 3 Analysis of variance

运用Design Expert 11对千里香总黄酮得率进行数据分析得到各因素的回归拟合方程为：

Y=9.65+0.182 7A+0.019 6B+0.236 4C+0.248 9AB+0.301 3AC-0.079 5BC-1.05A2-0.586 1B2-1.19C2

由表3结果显示，P＜0.000 1，说明该回归模型存在极显著差异。决定系数R2=0.979 5，修正系数R2Adj=0.953 1，低变异系数CV=2.52，则证明该回归模型拟合度良好。且失拟项P=0.287 2＞0.05，则表示该模型拟合度较高，不受失拟因素影响。证明该模型对预测千里香总黄酮得率稳定可靠。由表3可看出，A2、B2、C2具有极显著差异，A、C、AB、AC具有显著差异[29]。从表中F值可知，各因素对千里香总黄酮得率的影响顺序为微波功率（C）＞料液比（A）＞超声功率（B）。

料液比、超声功率、微波功率交互作用对千里香总黄酮得率的等高线与响应面3D图，见图4至图6。通过等高线与响应面3D图，可以清楚看到各因素间相互影响的显著性[30]。

图4 超声功率与料液比交互作用对千里香总黄酮提取率影响Fig.4 Effect of ultrasonic power and solid-liquid ratio interaction on extraction rate of total flavonoids from Murraya paniculata(L.)Jack

图6 微波功率与料液比交互作用对千里香总黄酮提取率的影响Fig.6 Effect of interaction between microwave power and solid-liquid ratio on the extraction rate of total flavonoids from Murraya paniculata(L.)Jack

从图4至图6中发现不同条件对实验结果的影响。当响应面的结果走势陡峭时，则证明此条件对实验结果影响程度较大。观察3组实验结果可以看出实验的3组条件均对千里香总黄酮得率都具有较大影响；料液比与微波功率间关系对得率的影响相对较大。

2.3 提取时间对千里香总黄酮得率的影响

参照1.2.2.2的流程及计算公式计算得出千里香总黄酮提取率见图7。

由图7所示，在10~30 min范围内千里香总黄酮得率随微波功率的增大而增大。在超过30 min后，提取率有下降，可能是长时间的加热接触，破坏了黄酮类成分的结构，使其热敏性物质被分解破坏。因此，选择30 min作为千里香总黄酮的提取时间。

图7 提取时间对提取率的影响Fig.7 The influence of extraction time on the extraction rate

通过对以上结果的分析整理发现，实验优化后的最佳提取条件为料液比为1:31.07（g/mL），超声功率为303.14 W，微波功率为411.23 W，提取时间为30 min，此条件下千里香总黄酮理论提取率为9.67%。由于实验操作需要，将千里香总黄酮的最佳提取条件调整：料液比为1:31（g/mL）、超声功率为303 W，微波功率为411 W，提取时间30 min。采用优化后的提取条件进行3次平行试验，实验测得的千里香总黄酮得率为9.53%与理论值9.67%接近，证明该实验方法具有可行性。

2.4 千里香总黄酮的体外抗氧化研究

2.4.1 千里香总黄酮和Vc对DPPH自由基的清除作用如图8所示，在实验设计浓度范围内，质量浓度的增大，千里香总黄酮和Vc对DPPH自由基清除率随之增强，在0.30 mg/mL时达到最大值，自由基清除率为千里香总黄酮83.16%、Vc 91.88%，且在高浓度时千里香总黄酮的清除率略低于Vc，从而可以证明千里香总黄酮也具有良好的抗氧化活性，其活性随浓度升高而增强。

图8 千里香总黄酮和Vc对DPPH自由基清除率的影响Fig.8 Effects of total flavonoids of Murraya paniculata(L.)Jack and Vc on the DPPH free radical scavenging rate

2.4.2 千里香总黄酮和Vc对羟自由基的清除作用如图9所示，在实验设计浓度范围内，随着质量浓度的升高，千里香总黄酮和Vc对羟自由基清除率随之增强，在0.30 mg/mL达到最大，清除率分别为千里香总黄酮85.15%、Vc 93.88%，整体千里香总黄酮的清除率略低于Vc，但说明千里香总黄酮具有良好的抗氧化活性，且与其质量浓度成正相关。

图9 千里香总黄酮和Vc对羟自由基清除率的影响Fig.9 Effects of total flavonoids of Murraya paniculata(L.)Jack and Vc of thyme on the hydroxyl radical scavenging rate

3 结论

本实验以千里香为研究对象，对千里香总黄酮采用超声波微波联合辅助提取，利用单因素试验对提取条件（料液比、超声功率和微波功率）进行考察，在单因素试验的基础上进行响应面试验设计。结果表明响应面分析的模型良好，准确度高。且对千里香总黄酮得率的影响为微波功率＞料液比＞超声功率，且提取千里香总黄酮最优条件：料液比为1:31（g/mL）、超声功率为303 W，微波功率为411 W，提取时间为30 min。采用优化后的提取条件，千里香总黄酮得率为9.53%，与预测值9.67%接近。在体外抗氧化活性试验中，千里香总黄酮在0.05~0.3 mg/mL范围内对DPPH及羟自由基的清除率均随着质量浓度得升高而变大，在0.30 mg/mL时清除率达到最大分别为83.16%和85.15%。表明千里香总黄酮有良好的抗氧化作用，且抗氧化活性与其质量浓度成正相关。通过本次研究可知，采用超声波微波联合辅助提取千里香总黄酮，具有操作简便、检测快速和数据准确等优点，且在抗氧化实验中证明其总黄酮具有良好的活性。本研究可为千里香总黄酮的进一步开发与应用提供理论基础。