一株毕赤酵母菌MC-1降解呕吐毒素、生物学特性及初步应用

2023-02-16邵春山余祖华廖成水贾艳艳李元晓曹平华何万领赵龙妹

中国饲料 2023年3期

邵春山，余祖华，廖成水，贾艳艳，李静，魏颖，李元晓，曹平华，何万领，赵龙妹，李旺，丁轲，*

（1.河南科技大学功能微生物与精准营养实验室，河南洛阳 471003；2.洛阳市活载体生物材料与动物疫病防控重点实验室，河南洛阳 471003）

呕吐毒素主要是由雪腐镰刀菌、禾谷镰刀菌等真菌产生的次级代谢产物（Yue等，2021）。农作物采收期间受到恶劣天气影响或者谷物储存不当等环境原因，致使真菌生长繁殖分泌霉菌毒素（Eriksen等，2021）。DON污染的农作物流入市场用于加工食品和饲料，会引发公共卫生安全隐患。动物采食被DON污染地饲料之后，身体会出现各种不良反应如呕吐、厌食症和营养不良等临床症状（Yue等，2021；Kang等，2019），并且还会造成消化系统紊乱。研究表明猪日粮含DON 8μg/kg饲养21 d后，猪肠上皮细胞造成氧化应激（Shen等，2021）。肝脏是动物体内最主要的解毒器官，有研究报道小鼠日粮中添加DON会引起小鼠肝细胞发生脂肪变性（Meng等，2021）。DON还会影响雄性动物前列腺类固醇的生成，导致动物产仔能力下降（Urbanek等，2021）。

为减少DON对动物和人的危害，人们使用各种降解DON的方法，目前主要有物理降解法、化学降解法和生物降解法。物理降解法和化学降解法较早用于降解饲料和食品中的DON，虽卓有成效但也有不尽人意之处（Yao和Long，2020）。有研究报道从海水中分离出耐盐远洋杆菌DON降解率为81%（Zhang等，2020）。运用微生物降解饲料和食物中DON是备受关注的方法，其中益生菌降解饲料和食品中的DON是最理想的方式（Franco等，2011）。

本研究从普洱茶茶叶中分离出一株毕赤酵母菌MC-1，通过研究其特性，为降解动物饲料中DON的菌株选择提供依据。

1 材料和方法

1.1 主要仪器和试剂酶标仪，4℃离心机，超声波破碎仪，紫外可见分光光度计，PCR扩增仪，凝胶成像系统，DON ELISA检测试剂盒（北京华安麦科生物科技有限公司），DON标准品（天津一方科技有限公司），细菌基因组提取提取试剂盒（北京天根），牛胆盐，胰蛋白酶，胃蛋白酶。

1.2 样品来源陈年普洱茶。

1.3 培养基 MRS固体培养基：酵母提取物5 g，琼脂15 g，葡萄糖20 g，MgSO4·7H2O 0.58 g，牛肉膏10 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，蛋白胨10 g，吐温1 mL，乙酸钠5 g，K2HPO42 g，柠檬酸氢三胺2 g，蒸馏水定容至1 L，121℃高压灭菌25 min。MRS液体培养基：固体培养基除去琼脂。模拟胃液：NaCl 2 g，胃蛋白酶3.5 g，蛋白胨1.2 g，酵母膏3.1 g，无菌水定容至1000mL，1mol/LHCl调pH为3，用0.22μm滤菌膜除菌。模拟肠液：NaHCO311 g，NaCl 2 g，胰蛋白酶1 g，牛胆盐1.2 g，无菌水定容至1000 mL，NaOH调pH为8.0，用0.22μm滤菌膜除菌。

1.4 样品处理样品采集后放入4℃冰箱备用。各取1 g，每个样品加入10 mL无菌水，充分振荡获得悬浮液，备用。1 mg DON标准品加入10 mL甲醛，4℃保存，作为母液备用。

1.5 具有降解DON目的菌富集与分离接种环蘸取上述样品混悬液划线于含有DON（1 mg/L）固体培养基，置于37℃恒温培养箱中（好氧、厌氧两种环境）倒置培养24 h，根据培养基上生长的形态不同单菌落，接种环挑取用于纯培养。初筛得到的具有不同形态的单菌落，划线到新的与其相对应的固体培养基平板上，放置于相应的培养环境中，反复纯化3次，待平板上生长的菌落形态一致，接种环挑取单菌落，保存于浓度为30%的甘油中，4℃保藏，备用。纯化之后的菌种接种含有1 mg/L DON液体培养基，37℃恒温培养24 h，用DON ELISA检测试剂盒检测毒素的残留量。

1.6 DON降解菌的鉴定肉眼观察MRS琼脂平板上菌落，光学显微镜对具有降解DON能力的菌株MC-1进行形态学观察。分子水平鉴定菌株MC-1使用ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG和ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC引物进行扩增，测序结果通过NCBI数据库的BLAST搜索。所得序列使用MEGA 7.0程序构建系统发育树。

1.7 菌株MC-1生物学特性试验

1.7.1 菌株MC-1生长曲线测定菌株MC-1按2%接种量接入200 mL MRS液体培养基，混匀后测OD600值，同时吸取0.1 mL菌株培养液稀释于0.9 mL无菌生理盐水，10倍梯度稀释。每个稀释度做3个重复，进行平板活菌计数。每隔2.0 h测OD600值和活菌数。以OD600值和活菌数（109cfu/mL）为纵坐标，时间为横坐标，GraphPad Prism8.0软件制作菌株MC-1生长曲线。

1.7.2 菌株MC-1耐盐试验菌株MC-1按2%接种量接入NaCl（质量浓度0、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%）100 mL MRS液体培养基中，在37℃摇床中180 r/min振荡培养24 h。分别取各浓度菌株培养液0.1 mL稀释于0.9 mL无菌生理盐水，10倍梯度稀释。每个稀释度做3个重复，进行平板活菌计数。

1.7.3 菌株MC-1耐胆盐试验菌株MC-1菌液接入含牛胆盐（质量浓度0.05%、0.1%和0.15%）100mLMRS液体培养基中，在37℃摇床中180r/min振荡培养。分别在0、2.0、4.0、6.0、8.0 h取0.1 mL菌株培养液稀释于0.9 mL无菌生理盐水，10倍梯度稀释。每个稀释度做3个重复，进行平板活菌计数。

1.7.4 菌株MC-1耐酸试验菌株MC-1分别接入pH为2、3、4的100 mLMRS液体培养基中，37℃厌氧静置培养，分别在0、1.0、2.0、3.0 h取0.1 mL培养液，稀释于0.9 mL无菌生理盐水中，10倍梯度稀释。每个稀释度做3个重复，进行平板活菌计数。

1.7.5 毕赤酵母菌MC-1模拟胃液和模拟肠液耐受性试验毕赤酵母菌MC-1取10 mL，3000 r/min离心20 min，弃上清，无菌生理盐水洗涤3次，洗涤结束后无菌生理盐水重新悬浮。取菌悬液0.1 mL接入0.9 mL pH为3.0人工胃液中，37℃厌氧静置培养；在0、1.0、2.0、3.0 h取0.1 mL培养液稀释于0.9 mL无菌生理盐水中，10倍梯度稀释。每个稀释度做3个重复，进行平板活菌计数。上述处理后3.0 h培养液接种于人工肠液中，37℃厌氧静置培养，分别于0、2.0、4.0、6.0、8.0 h吸取0.1 mL培养液稀释于0.9 mL无菌生理盐水中，10倍梯度稀释。每个稀释度做3个重复，进行平板活菌计数。

1.7.6 菌株MC-1降解DON的活性成分定位试验菌株MC-1培养液5 mL在4℃、6000 r/min条件下离心20 min；获取无细胞上清液，低温保存备用。同时超声波破碎仪将菌体破碎，破碎后菌体用无菌PBS缓冲液清洗2次后，第3次用无菌PBS缓冲液重悬菌体碎片。经上述处理后，无细胞上清液和菌体碎片加入DON（1μg/mL），含相同浓度DON无菌PBS缓冲液为空白对照，37℃、180 r/min恒温摇床中振荡培养48 h，DON ELISA检测试剂盒检测各处理组DON的残留量。

1.8 菌株MC-1在饲料原料中降解DON试验从市面上购买的饲料原料分别有玉米粉、大豆粉和豆粕。饲料原料灭菌前进行DON ELISA检测试剂盒检测毒素含量，饲料原料分成3份，每份100 g，密封放入高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌30 min。灭菌后饲料原料放入无菌锥形瓶，加入无菌水500 mL。将上述处理的饲料原料中加入600μg的DON纯品和12 mL菌株MC-1菌液，添加完毕后混匀放入37℃恒温箱静置厌氧培养48 h。培养结束后用DON ELISA检测试剂盒重复3次检测毒素含量并计算结果。

2 结果与分析

2.1 DON降解菌的筛选结果普洱茶样品初筛分离出18株在（1 mg/L DON）MRS培养基平板上生长的菌株，复筛得到7株DON降解率15.21%～59.21%菌株。如图1所示7株菌其中MC-1经过DON ELISA检测试剂盒重复检测3次之后DON降解率为59.21%。菌株MC-1菌落颜色呈灰白色，菌落边缘不规则且略显湿润的菌落形态（图2）。革兰氏染色后菌体形态呈蓝紫色米粒状，因此确定菌株MC-1属于革兰氏阳性细菌（图3）。菌株MC-1细菌基因组测序，所得基因序列在BLAST比对结果同源性系数与登录号MN784687.1:32-442 Pichia sp.strain 1705亲缘关系最相近，同源性达100%。MEGA7.0软件构建系统发育树并进行序列比对分析，将分离目的菌株命名为毕赤酵母菌MC-1（图4）。

图1 复筛菌株DON的降解率

图2 MC-1菌落形态

图3 MC-1镜检菌体形态

图4 MC-1同源性进化树

2.2 菌株MC-1生长曲线测定结果菌株MC-1在培养0～6 h处于迟缓期，6.0～22.0 h时处于对数生长期，菌株在生长22～24 h处于稳定期24 h之后出现衰亡期。菌株MC-1在生长24 h时达到最大活菌数8.87×1010cfu/mL（图5）。

图5 菌株MC-1生长曲线

2.3 菌株MC-1耐盐试验结果由图6可知，菌株MC-1在盐质量浓度1%～7%培养24 h后，存活率依次为100%、80.2%、61.2%、33.5%、18.2%、5.6%、1.1%、0.012%，表明菌株MC-1对盐溶液具有耐受性。

图6 菌株MC-1耐盐试验

2.4 菌株MC-1耐胆盐试验结果由图7所示，MC-1在三种胆盐浓度（0.05%、0.1%、0.15%）培养8.0 h后存活率分别为99.43%、76.88%、11.61%，表明菌株MC-1对胆盐具有一定耐受能力。

图7 菌株MC-1耐胆盐试验

2.5 菌株MC-1耐酸试验结果由图8可知，菌株MC-1在pH分别为2、3、4培养3.0 h，菌株MC-1存活率分别为17.02%、35.28%、99.21%，表明菌株MC-1对酸性环境具有耐受性。

图8 菌株MC-1耐酸试验

2.6 菌株MC-1模拟胃液试验结果由表1所示，菌株MC-1在pH 3的模拟胃液中耐受0、1.0、2.0、3.0 h后存活率分别为100%、57.83%、36.64%、10.37%；菌株MC-1能够在模拟胃液中存活。

表1 MC-1对模拟胃液的耐受性

2.7 菌株MC-1模拟肠液耐受性试验结果由表2所示，菌株MC-1在pH 8的模拟胃液中耐受0、2.0、4.0、6.0、8.0 h后存活率分别为100%、63.58%、43.04%、25.76%、16.96%，表明菌株MC-1能够在模拟肠液中存活。

表2 菌株MC-1对模拟肠液的耐受性

2.8 菌株MC-1降解DON的活性成分定位试验结果如图9所示，菌株MC-1的无细胞上清液DON降解率为54.76%，菌体裂解物DON降解率为23.73%，表明菌株MC-1无细胞上清液对DON发挥主要降解作用。

图9 菌株MC-1不同活性成分对DON的降解率

2.9 菌株MC-1在饲料原料中降解呕吐毒素试验结果如图10所示，菌株MC-1对玉米粉、大豆粉和豆粕DON降解率分别为29.60%、41.94%和46.79%，表明菌株MC-1能够在饲料原料中降解DON。

图10 菌株MC-1对不同饲料原料中DON的降解率

3 讨论

本研究目的是运用益生菌降解动物饲料中的DON。人类使用酵母菌的历史由来已久，酵母菌的使用改变了人类饮食结构和生活方式。有研究报道从海底古沉船中打捞出酒坛样品分离出酿酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae Hansen）（Thomast等，2021）。随着人们对酵母菌的研究越来越深入且不断发现酵母菌能够产生很多有工业价值的生物活性物质，有研究发现酵母菌能够产生阿拉伯糖醇用于食品工业用的甜味剂（Agbogbo和Coward-Kelly，2008）。毕赤酵母菌能够用于降解纤维素产生燃料酒精（Kordowska-Wiater，2015），南美洲国家巴西当地运用酵母菌发酵甘蔗生产生物燃料（Ceccato-Antonini和Covre，2021）。

本研究分离出毕赤酵母菌MC-1的样品来自普洱茶，茶叶发酵过程中需要益生菌参与发酵改变口感和风味（Tian等，2014）。参与普洱茶发酵菌群具有多样性，不同的细菌分泌不同的胞外物质使得茶叶发生质变（Niu等，2018）。毕赤酵母MC-1不仅能够降解DON，还具有耐酸、耐胆盐、生长24 h后达到最大活菌数，能够在模拟胃液和模拟肠液中存活；有研究报道从酒曲中分离出毕赤酵母菌进行体外益生试验后，断奶仔猪体内试验证明该菌能够降低仔猪腹泻（Ma等，2021；Lim等，2015）。毕赤酵母菌MC-1对盐溶液耐受性相比乳酸菌而言较差，这可能与酵母菌属于真核细菌有关。研究报道裂解多糖单加氧酶（LPMOs）在毕赤酵母菌中转化表达之后在6%NaCl溶液中产酶可分解聚合纤维素（Patel等，2016）。本研究活性成分定位试验结果表明，无细胞上清液对DON起主要降解作用，其次是菌体裂解物。试验结果证明毕赤酵母菌MC-1可能有两种机制降解DON。毕赤酵母菌MC-1菌体裂解物对DON具有吸附降解作用，目前有很多报道革兰氏阳性菌和真菌对霉菌毒素具有吸附降解功能。这些细菌细胞壁主要成分含有肽聚糖和葡聚糖，这些是对DON构成物理吸附的主要原因且本身对DON结构没有破坏（Zhai等，2019；Zoghi，2014）。无细胞上清液含有细菌分泌的胞外生物活性物质，这些生物活性物质使DON的化学结构改变起到降解DON的作用。从麦田泥土中分离出一株能够分泌（AKR18A1）醛酮还原酶降解呕吐毒素的鞘氨醇单胞菌S3-4，该酶能够通过连续发生酶反应达到破坏DON化学结构目的（He等，2017）。有研究报报道从土壤中分离出一株革兰氏阴性菌德文菌16能够高效降解DON，检测其代谢产物是3-keto-DON（Wang等，2019）。酵母菌生长地同时不断分泌有机酸导致上清液的pH降低（Guo等，2021）；DON在pH 2强酸环境能够使DON脱环氧化形成DOM-1（Mishra等，2014）。随着溶液酸碱度越低转化率就越高，毕赤酵母菌MC-1上清液能够降解DON可能与自身分泌有机酸有一定关系;酵母菌不仅能够吸附污水中的重金属、霉菌毒素，还具有抑制霉菌生长的作用（Garcia-Bejar等，2020）。本试验中，表明毕赤酵母菌MC-1在玉米粉、大豆粉和豆粕DON降解率分别为29.60%、41.94%、46.79%。益生菌作为食品和动物饲料的微生物添加剂由来已久（余祖华和丁轲，2016），酵母菌发酵食品和饲料原料是一个缓慢厌氧放热过程，原料中有机分子被生物活性物质分解成简单的有机质，酵母菌因原料不同产酶量也不同（Aslam等，2020）。以上因素可能是造成毕赤酵母菌MC-1在饲料原料降解率不同的原因，其详细机制需要进一步研究。本研究从普洱茶茶叶中分离出能够降解DON的毕赤酵母菌MC-1且无细胞上清液能够降解DON，这与绝大多数酵母菌吸附降解霉菌毒素有所不同。