益肾补骨汤对骨质疏松症大鼠骨形成和一氧化氮-环磷酸鸟苷信号通路的影响Δ

王勤俭，张睿昕

(河南省中医院/河南中医药大学第二附属医院骨病二科，郑州 450000)

骨质疏松症是临床上常见的全身性疾病，该病患者骨量明显降低，骨微结构受到明显破坏，严重者可导致患者发生骨折[1]。研究结果发现，导致骨质疏松症的危险因素有多种，包括钙摄入量不足、性激素失调、吸烟和饮酒等，其中女性绝经后骨质疏松是重要的危险因素之一[2-4]。绝经后骨质疏松症(postemnopausal osteoporosis，PMOP)是一类全身代谢性骨病，其为绝经妇女因体内的雌激素分泌减少，骨量降低导致骨纤维结构退化，进而发生骨质疏松。目前，临床主要采用降钙素、双磷酸盐、氟化物和维生素D等药物治疗骨质疏松症，但由于以上药物的疗效并不十分理想且不良反应显著，因此其在临床的使用受到一定限制[5]。近年来，随着中医理论的不断发展，学者们认为导致PMOP的主要因素为肾虚[6]。研究结果发现，益肾补骨汤对促进骨细胞和骨保护素表达、抑制骨吸收有很好的作用[7]。近年来的研究结果表明，一氧化氮/环磷酸鸟苷(NO/cGMP)信号通路介导骨代谢，NO不仅可抑制破骨细胞骨吸收，还能促进成骨细胞的分化，NO被成骨细胞释放后可激活鸟苷酸环化酶，进而增加cGMP的形成，同时NO能通过激活受体Ⅱ型cGMP依赖性蛋白激酶的表达，促进成骨细胞分化[8-9]。但关于NO/cGMP通路在PMOP中的作用机制研究较少，因此，本研究旨在探讨益气补骨汤对PMOP大鼠骨形成及NO/cGMP通路的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

本实验60只SD大鼠均购自河南省实验动物中心，许可证号：SCXK(豫)2017-0001。大鼠为2个月龄，SPF级，雌性未生育，体重为200～240 g。将大鼠饲养在统一的动物房内，保持室内温度为24～26 ℃，相对湿度为50%～70%，室内光照12 h/12 h循环，每日自由饮水、进食普通饲料。适应性饲养大鼠7 d。动物实验在我院伦理委员会批准下进行，并按照实验动物使用的3R原则给予人道关怀。

1.2 仪器

TXK4型离心机(长沙英泰仪器有限公司)；双能X线骨密度仪[博卓生物科技(上海)有限公司]；124型万分之一分析天平(日本Shimadzu公司)。

1.3 药品与试剂

益肾补骨汤由葛根60 g、山药30 g、川续断30 g、穿山甲30 g、淫羊藿30 g、补骨脂30 g、黄芪30 g、茯苓20 g、鹿角霜20 g、熟地黄15 g、当归15 g和红花10 g组成；上述中药购于南京药业股份有限公司，由我院制剂室制成水煎液，加水2 000 mL浸泡上述药物2 h，取出药物用水煎煮40 min，共煎煮2次；将2次的煎煮液合并并浓缩为1 g/mL的溶液，于4 ℃冰箱冷藏备用。戊酸雌二醇用蒸馏水溶化制备为0.1 mg/mL的溶液。Wnt3a、β-catenin抗体和辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(货号：ab54479、ab32572和ab6721，美国Abcam公司)；磷酸缓冲盐溶液(货号：P1020，南京森贝伽生物科技有限公司)；NO酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒、苏木精-伊红(HE)染色试剂盒(货号：BC1475、G1120，北京索莱宝科技有限公司)；cGMP ELISA试剂盒(货号：LM-cGMP-Ge，上海联迈生物工程有限公司)。

1.4 分组与模型制备

将大鼠按照随机数字表法分为六组，即sham组、PMOP组、益肾补骨汤L组、益肾补骨汤M组、益肾补骨汤H组和阳性对照组，各10只。各组大鼠均腹腔注射300 mg/kg水合氯醛麻醉，沿大鼠腹部正中线切一2 cm的小口，在肋弓脊柱旁1 cm处将肌肉切开，将卵巢组织充分暴露在外，取出卵巢组织并将脂肪组织分离，将卵巢下方的输卵管和血管进行结扎；后切除大鼠卵巢组织并固定，缝合大鼠皮肤。sham组大鼠仅将卵巢暴露后再放回，不切除，逐层缝合皮肤。术后各组大鼠均给予青霉素钠盐5万IU/d腹腔注射，预防感染，连续注射3 d。用双能X线骨密度仪检测大鼠右侧股骨密度(BMD)，判断模型是否制备成功。造模过程中，有3只大鼠造模失败，予以补充后进行后续实验。

1.5 给药方法

益肾补骨汤L组、益肾补骨汤M组和益肾补骨汤H组大鼠分别给予益肾补骨汤2、4和8 mL/kg灌胃干预，阳性对照组大鼠给予戊酸雌二醇0.09 mg/kg灌胃干预，sham组和PMOP组大鼠均给予等量的0.9%氯化钠溶液干预。所有大鼠给药均1日1次，共给药12周。

1.6 标本收集及处理

末次给药后，各组大鼠均禁食12 h，自由饮水，记录各组大鼠体重变化，观察各组大鼠一般情况的变化，包括精神状态、毛发、活动和大小便等。称量后麻醉各组大鼠，取各组大鼠腹主动脉血，静置30 min后离心(3 000 r/min，离心半径5 cm)5 min，收集上清液，于-80 ℃环境中保存。剥离大鼠双侧股骨，剔除肌肉组织和结缔组织后用0.9%氯化钠溶液冲洗，固定左侧股骨组织于10%甲醛溶液中，48 h后浸泡于10%硝酸中，待到用缝合针能够刺进骨组织时为脱钙成功。用流水冲洗组织，12 h后取1 cm3股骨用于制作病理切片。

1.7 ELISA法检测血清总碱性磷酸酶(TALP)、血清抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)含量

将“1.6”中保存于-80 ℃冰箱中的血清取出并解冻，用ELISA检测试剂盒检测各组大鼠血清TALP、TRAP含量。

1.8 BMD测定

分别取各组大鼠右侧股骨组织，剔除周围的肌肉组织和结缔组织，以0.9%氯化钠溶液冲洗后用0.9%氯化钠溶液纱布包裹，用双能X线骨密度仪检测各组大鼠的BMD。将股骨置于双能X线骨密度仪探头处进行检测，应用小动物学骨密度测试软件进行股骨颈BMD分析。测定完毕后，用湿纱布再次包裹股骨，用保鲜膜将股骨密封，保存于-80 ℃冰箱中，用于后续实验。

1.9 股骨HE染色

取“1.6”中1 cm3股骨组织，石蜡包埋，切成厚度为4 μm的薄片，将薄片脱水处理后，用苏木精染色5 min，伊红染色1 min，再次脱水后透明组织并干燥，最后用中性树脂封片，将股骨组织置于倒置显微镜下观察其形态结构。

1.10 股骨组织中NO、cGMP含量测定

取“1.6”中股骨组织，加入蛋白裂解液，将股骨组织置于含有冰冷0.9%氯化钠溶液的玻璃匀浆器中制成质量分数为10%的股骨组织匀浆，1 500 r/min，4 ℃离心(离心半径5 cm)20 min，取上清液。用分光光度计法检测血清中NO含量，用放射免疫法测定血清中cGMP含量，操作步骤按照试剂盒说明书进行。

1.11 蛋白质印迹法检测股骨组织中Wnt3a、β-catenin的表达

取各组大鼠股骨组织，于冰上裂解组织至组织匀浆，离心组织匀浆，用二喹啉甲酸法检测上清液中蛋白浓度。分别配置浓缩胶和分离胶，浓度分别为5%和8%，在胶孔中分别加入样品蛋白，电泳10 min后转膜。孵育2 h后，将5%封闭液加入到样品中，激活后转移至PVDF膜上，封闭PVDF膜1 h。分别加入一抗Wnt3a、β-catenin过夜，继续加入HRP标记的二抗，继续孵育2 h。用电化学发光试剂盒检测细胞PVDF膜并成像。

1.12 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠一般状态比较

术前，各组大鼠体重的差异无统计学意义(P>0.05)，见表1、图1(A)。术后，PMOP组大鼠行动较sham组明显迟缓，活动变少，体毛粗糙无光，食欲降低，部分大鼠存在粪便稀软现象；益肾补骨汤L、M及H组大鼠以上情况得到改善明显，益肾补骨汤H组和阳性对照组大鼠活动状况、体毛、饮食及粪便情况相似。PMOP组大鼠体重明显低于sham组(P<0.05)；益肾补骨汤L组、M组和H组大鼠体重明显高于PMOP组，且益肾补骨汤H组和阳性对照组大鼠体重高于益肾补骨汤L组、M组(P<0.05)，差异均有统计学意义，见图1(B)。

A.各组大鼠实验前体重比较；B.各组大鼠实验后不同时间体重比较；与sham组相比，aP<0.05；与PMOP组相比，bP<0.05；与益肾补骨汤L组相比，cP<0.05；与益肾补骨汤M组相比，dP<0.05

表1 各组大鼠实验前体重比较

2.2 各组大鼠血清中TALP、TRAP含量比较

PMOP组大鼠血清TALP含量明显低于sham组，TRAP含量明显高于sham组；益肾补骨汤L组、M组及H组大鼠血清TALP含量明显高于PMOP组，TRAP含量明显低于PMOP组；益肾补骨汤H组大鼠血清中TALP含量高于益肾补骨汤L组、M组，TRAP含量低于益肾补骨汤L组、M组，上述差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 各组大鼠血清TALP、TRAP含量比较

2.3 各组大鼠BMD和股骨组织形态变化比较

与sham组相比，PMOP组大鼠股骨BMD降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与PMOP组相比，益肾补骨汤L组、M组及H组BMD均不同程度升高，且呈浓度依赖，差异均有统计学意义(P<0.05)；益肾补骨汤H组大鼠股骨BMD与阳性对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)，见表3、图2(A)。与sham组相比，PMOP组大鼠骨小梁间隙变大不规则，粗细不均匀，骨小梁表型更薄；与PMOP组相比，益肾补骨汤L组、M组、H组和阳性对照组大鼠骨小梁间隙均不同程度变小，且骨小梁粗细均匀且逐渐规则，见图2(B)。

A.各组大鼠股骨BMD比较；B.各组大鼠股骨组织HE染色；与sham组相比，aP<0.05；与PMOP组相比，bP<0.05；与益肾补骨汤L组相比，cP<0.05；与益肾补骨汤M组相比，dP<0.05

表3 大鼠股骨BMD比较

2.4 各组大鼠股骨组织中NO、cGMP含量比较

与sham组相比，PMOP组股骨组织中NO、cGMP含量升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；益肾补骨汤L组、M组及H组大鼠股骨组织中NO、cGMP含量明显低于PMOP组，且随着浓度升高降低越显著，差异均有统计学意义(P<0.05)；益肾补骨汤H组与阳性对照组大鼠股骨组织中NO、cGMP含量的差异无统计学意义(P>0.05)，见表4。

表4 各组大鼠股骨组织中NO、cGMP含量比较

2.5 各组大鼠股骨组织中Wnt3a、β-catenin蛋白表达比较

与sham组相比，PMOP组大鼠股骨组织中Wnt3a、β-catenin蛋白表达明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；益肾补骨汤L组、M组及H组大鼠股骨组织中Wnt3a、β-catenin蛋白表达明显高于PMOP组，且呈剂量依赖性，差异均有统计学意义(P<0.05)；益肾补骨汤H组与阳性对照组大鼠股骨组织中Wnt3a、β-catenin蛋白表达的差异无统计学意义(P>0.05)，见表5、图3。

与sham组相比，aP<0.05；与PMOP组相比，bP<0.05；与益肾补骨汤L组相比，cP<0.05；与益肾补骨汤M组相比，dP<0.05

表5 各组大鼠股骨组织中Wnt3a、β-catenin蛋白表达比较

3 讨论

PMOP是妇女的常见病，主要由于机体中的雌激素水平降低导致骨量大量丢失所致[10]。激素替代治疗是防止60岁以下女性骨质疏松症的一线选择，但对60岁及60岁以上的女性预防骨质疏松症的治疗不作为首选，主要因为激素替代治疗会引起乳腺癌、心血管不良事件的发生风险升高[11]。因此，安全有效地缓解PMOP的药物成为研究的热点。中医认为，骨质疏松症是由肝肾亏虚、淤血阻滞所致，《医经精义·中卷》中认为，肾精逐渐衰弱，骨髓生化无源、骨髓空虚，进而导致肾虚型PMOP发生[12]。有学者发现，PMOP通常为机体中骨吸收和骨形成出现失衡所致，属于高转换型骨质疏松症[13]。近年来研究结果发现，中药治疗PMOP的疗效显著[14]。益肾补骨汤方中葛根可祛热升阳；黄芪、山药有益气健脾的功效；熟地黄、补骨脂可补肾填髓，滋阴养肝，强筋壮骨续折伤；穿山甲、当归具有益气健脾、活血化瘀等功效；以上药物共用，不仅可补肾健脾，还可活血化瘀、强筋健骨。

目前，临床上多通过测定BMD来判定骨质疏松症，其可有效反映骨骼中骨矿物质的含量[15]。本研究通过测定各组大鼠BMD以验证PMOP大鼠模型制备是否成功，结果发现，PMOP组大鼠体重降低，猜测可能是因为雌激素水平降低、内分泌紊乱，进而影响体重。骨代谢生化指标通常可对机体中的骨吸收和骨形成情况进行有效反映，目前临床上反映骨形成情况的指标有多种，如碱性磷酸酶、骨钙素等[16]。本研究通过检测血清TALP水平来反映新骨的生成情况，通常骨质疏松症患者的新骨形成明显少于正常人群，且反映新骨形成的血清指标活性也会降低。本研究结果显示，PMOP组大鼠血清TALP水平明显降低，益肾补骨汤L组、M组及H组大鼠血清TALP水平显著高于PMOP组，提示益肾补骨汤可促进PMOP大鼠的新骨生成。临床上通常用血清TRAP、降钙素和甲状旁腺激素等指标反映骨吸收情况。本研究通过检测血清TRAP水平反映骨吸收情况，结果显示，PMOP组大鼠血清TRAP水平明显升高，可见PMOP大鼠骨吸收增加，骨量大量减少，益肾补骨汤治疗后大鼠血清TRAP水平显著降低，提示益肾补骨汤可抑制PMOP大鼠骨吸收情况。韩龙等[17]的研究结果证实，与假手术组相比，骨质疏松症模型组大鼠血清TALP水平降低，TRAP水平升高，与本研究结果一致。

NO参与并调控骨重建等多种生理过程，可与可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)的血红素基团相结合，通过提高sGC活性而提高cGMP水平，进而激活cGMP依赖性蛋白激酶级联，同时激活下游信号通路发挥生理活性作用[18]。体外实验结果显示，成骨细胞自身可产生少量的NO，其可调节成骨细胞内生长因子的产生。NO供体内NO的缓慢释放诱导体外成骨细胞的生长和分化[19]。本研究结果显示，PMOP大鼠血清中NO、cGMP含量升高，益肾补骨汤干预后大鼠股骨组织中NO、cGMP含量显著降低，提示益肾补骨汤可降低PMOP大鼠股骨组织中NO、cGMP含量，进一步证明益肾补骨汤在促进骨形成过程中与抑制NO/cGMP信号通路有关。宋明甲等[20]的研究结果证实，7-甲氧基-4’-羟基异黄酮可通过NO/cGMP/sGC信号通路促进体外培养成骨细胞成熟与矿化。

Wnt3a是Wnt蛋白家族成员之一，Wnt信号通路可调节骨重建等过程，是骨质疏松的重要病理基础。在Wnt/β-catenin信号通路中，β-catenin是关键的调节因子，在骨形成过程中β-catenin水平降低，其可通过升高碱性磷酸酶水平并降低BMD，进而介导骨质疏松的发生发展[21]。本研究结果显示，益肾补骨汤可增加PMOP大鼠股骨组织中Wnt3a和β-catenin蛋白表达，提示益肾补骨汤可能通过增加股骨组织中Wnt3a和β-catenin蛋白表达来治疗骨质疏松症。邢威等[22]的研究结果证实，杜仲健骨方可通过调控Wnt/β-catenin信号通路来发挥治疗骨质疏松症的作用。

综上所述，益肾补骨汤可促进骨质疏松症大鼠的骨形成，可能是通过抑制NO/cGMP信号通路抑制骨吸收。