反相高效液相色谱法测定加味四妙勇安汤中绿原酸和梓醇的含量Δ

李慧红，李 敏，关红亚，韩鹏黎，刘 嘉，成 龙，曹 巍，周丽娟#

(1.郑州大学附属郑州中心医院转化医学中心，郑州 450007； 2.郑州大学附属郑州中心医院药学部，郑州 450007； 3.中国医学科学院药用植物研究所分析研究中心，北京 100094)

四妙勇安汤首见于《华佗神医秘传》，主要由金银花、玄参、当归和甘草组成，其比例为3∶ 3∶ 2∶ 1[1-3]。本课题组前期采用数据挖掘技术针对糖尿病视网膜病变初期，在四妙勇安汤方的基础上筛选优化出加味四妙勇安汤(金银花、玄参、地黄、当归、丹参和甘草)，应用动物模型初步评价其对db/db小鼠具有降糖作用。四妙勇安汤主清热解毒、活血止痛，加味四妙勇安汤方中增加了丹参和地黄，增强了滋阴清热之功，同时有祛瘀通络之效。四妙勇安汤作为治疗热毒性脱疽的经典古方，研究结果表明，其抗炎作用与金银花中的绿原酸相关[4]。现代药理学研究结果显示，绿原酸为金银花主要水溶性成分[5-6]。相关研究结果证实，从血管内皮保护的角度，绿原酸具有改善糖尿病视网膜病变的作用[7]。梓醇作为地黄的最主要的活性成分，具有降血糖、利尿、缓和泻下等作用[8]。本研究按照提取工艺对加味四妙勇安汤的药材进行水提，采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)对方中君药金银花的主要成分绿原酸和臣药地黄的主要成分梓醇的含量进行测定，为加味四妙勇安汤提取物的提取工艺及质量控制提供依据。

1 材料

1.1 仪器

1260型Agilent HPLC仪(美国Agilent公司)；TQX-150AH超声波清洗器(山东新华医疗器械股份有限公司)；ML303E电子分析天平(梅特勒托利多仪器上海有限公司，精度为十万分之一)。

1.2 药品与试剂

加味四妙勇安汤：金银花(河南，批号为20200201)、玄参(浙江，批号为210518)、生地黄(河南，批号为210710)、当归(甘肃，批号为201010)、丹参(山东，批号为210810)和甘草(新疆，批号为210302)，均购自国药控股股份有限公司。绿原酸对照品(批号为110753-202018，含量为96.1%)、梓醇对照品(批号为110808-202112，含量为98.8%)购自中国食品药品检定研究院。乙腈为色谱级，其余试剂均为分析纯，miliQ超纯水。

2 方法与结果

2.1 加味四妙勇安汤提取物的制备

通过L9(34)正交试验优选制备工艺[9]，以浸膏量及绿原酸的含量为综合评价指标，选定最佳提取工艺为：加8倍量水，密封煎煮3次，每次1 h。提取液滤过，滤液合并，浓缩至1 g浸膏约相当于1.35 g原药材，同法制备3批样品(批号为20211117、20211119和20211121)。

2.2 绿原酸的测定

2.2.1 色谱条件：色谱柱为Merck Purospher® STARLP RP-18 endcapped柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈-0.4%磷酸(V∶V=11∶ 89)；流速为1.0 mL/min；检测波长为327 nm；柱温为35 ℃；进样体积为5 μL[10-11]。

2.2.2 溶液制备：(1)对照品溶液的制备。称取绿原酸对照品，精密称定质量为4.60 mg，置于10 mL棕色容量瓶中，用50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成含绿原酸442.0 μg/mL的储备液。精密量取适量，加50%甲醇稀释成44.20 μg/mL的绿原酸对照品溶液。(2)供试品溶液的制备。精密称取加味四妙勇安汤提取物(批号为20211117)1.149 01 g，置于锥形瓶中，加入50%甲醇30 mL，超声(频率100 Hz)30 min，冷却，转入50 mL容量瓶中，定容，经微孔滤膜(0.22 μm)滤过，续滤液即为供试品溶液。(3)阴性样品溶液的制备。取除去金银花的加味四妙勇安汤组方，按“2.1”法提取后，按“2.2.2(2)”项下方法制备阴性样品溶液。

2.2.3 方法学考察：(1)系统适用性试验。精密量取“2.2.2”项下对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液，按“2.2.1”项下方法进样测定。结果绿原酸峰理论塔板数为11 098，与前后杂质的分离度为12.79和2.73，见图1。

A.对照品溶液；B.供试品溶液；C.阴性样品溶液；1.绿原酸(tR=11.219 min)

(2)线性关系考察。精密量取“2.2.2(1)”项下绿原酸储备液适量，加50%甲醇溶液依次稀释，分别制成含绿原酸质量浓度为442.0、176.8、44.20、22.10、8.840和4.420 μg/mL的对照品溶液。按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，以横坐标为对照品溶液质量浓度(C，μg/mL)，纵坐标为峰面积(Y)绘制标准曲线，得回归方程Y=16.224C-38.659，r=0.999 8(n=6)。结果表明，绿原酸在4.420～442.0 μg/mL范围内质量浓度与峰面积成良好的线性关系。

(3)最低检测限和定量限。精密量取44.20 μg/mL对照品溶液，加50%甲醇依次稀释进样测定，当S/N≥3时，最低检测限度为0.40 ng；当S/N≥10时，定量限为1.20 ng。

(4)精密度试验。取44.20 μg/mL绿原酸对照品溶液，按“2.2.1”项下方法连续进样6次，记录色谱图。结果显示，绿原酸峰面积的RSD为0.71%(n=6)，表明仪器精密度良好。

(5)稳定性试验。取供试品溶液，分别在0、1、2、4、8和12 h各测定1次。结果显示，绿原酸峰面积的RSD为0.92%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

(6)重现性试验。称取加味四妙勇安汤提取物(批号为20211117)适量，精密称定，按“2.2.2(2)”项下方法制成供试品溶液6份，分别进样测定，记录色谱图，计算绿原酸的含量。结果显示，绿原酸平均含量为(2.35±0.03)mg/g，RSD为1.19%。

(7)加样回收试验。取样品(批号为20211117，绿原酸含量为2.35 mg/g)约1 g，共9份，各精密称定，按“2.2.2(2)”项下方法制备。各精密量取2 mL，分别置于5 mL容量瓶中，精密加入442.0 μg/mL绿原酸对照品溶液160、200和240 μL各3份，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，按“2.2.1”项下方法进样测定，计算回收率，结果见表1。

表1 绿原酸加样回收试验结果(n=9)

2.3 梓醇的测定

2.3.1 色谱条件：色谱柱为Merck Purospher® STARLP RP-18 endcapped柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈(A)-0.1%磷酸(B)，梯度洗脱(0～15 min，0.8%A；15～60 min，2%A)；流速为1.0 mL/min；检测波长为210 nm；柱温为35 ℃；进样体积为20 μL[12-13]。

2.3.2 溶液的制备：(1)对照品溶液的制备。称取梓醇对照品，精密称定质量为4.94 mg，置于10 mL棕色容量瓶中，用0.1%磷酸溶解并稀释至刻度，摇匀，制成含梓醇488.0 μg/mL的储备液。精密量取适量，加0.1%磷酸稀释成48.80 μg/mL的梓醇对照品溶液。(2)供试品溶液的制备。精密称取加味四妙勇安汤提取物(批号为20211117)1.211 86 g，置于25 mL容量瓶中，加入甲醇20 mL，超声(频率100 Hz)处理30 min，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，过滤，取续滤液10 mL置于锥形瓶中，浓缩，残渣加0.1%磷酸溶解，转至10 mL容量瓶中，加0.1%磷酸至刻度，摇匀，经微孔滤膜(0.22 μm)滤过，续滤液即为供试品溶液。(3)阴性样品溶液的制备。取除去地黄的加味四妙勇安汤组方，按“2.1”项下方法提取后，按“2.3.2(2)”项下方法制备阴性样品溶液。

2.3.3 方法学考察：(1)系统适应性试验：精密吸取“2.3.2”项下制备的对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液，按“2.3.1”项下方法进样测定。结果显示，梓醇峰理论塔板数为10 372，与前后杂质的分离度为1.51和3.68，见图2。

A.对照品溶液；B.供试品溶液；C.阴性样品溶液；1.梓醇(tR=10.125 min)

(2)线性关系考察。精密量取“2.3.2(1)”项下梓醇储备液适量，加0.1%磷酸依次稀释，分别制成含梓醇质量浓度为488.0、244.0、97.60、48.80、24.40和9.760 μg/mL的对照品溶液。按“2.3.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，以横坐标为对照品溶液质量浓度(C，μg/mL)，纵坐标为峰面积(Y)绘制标准曲线，得回归方程Y=4.920 3C+6.484 3，r=0.999 9(n=6)。结果表明，梓醇在9.760～488.0 μg/mL范围内质量浓度与峰面积成良好的线性关系。

(3)最低检测限和定量限。精密量取48.80 μg/mL梓醇对照品溶液，加0.1%磷酸依次稀释进样测定，当S/N≥3时，最低检测限度为0.82 ng；当S/N≥10时，定量限为2.44 ng。

(4)精密度试验。取48.80 μg/mL梓醇对照品溶液，按“2.3.1”项下方法连续进样6次，记录色谱图。结果显示，梓醇峰面积的RSD为0.45%(n=6)，表明仪器精密度良好。

(5)稳定性试验。取供试品溶液，分别在0、1、2、4、8和12 h各测定1次。结果显示，梓醇峰面积的RSD为0.88%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

(6)重现性试验。取加味四妙勇安汤提取物(批号为20211117)适量，按“2.3.2(2)”项下方法制成供试品溶液6份，分别进样测定，记录色谱图，计算梓醇含量。结果显示，梓醇平均含量为(0.872 1±0.012 6)mg/g，RSD为1.44%。

(7)加样回收试验。取样品(批号为20211117，梓醇含量为0.872 1 mg/g)约1 g，共9份，各精密称定，按照“2.3.2(2)”项下方法制备。各精密量取2 mL，分别置于5 mL容量瓶中，精密加入488.0 μg/mL梓醇对照品溶液160、200和240 μL各3份，加0.1%磷酸稀释至刻度，摇匀，按“2.3.1”项下方法进样测定，计算回收率，结果见表2。

表2 梓醇加样回收试验结果(n=9)

2.4 样品测定

取3批样品，分别按“2.2.1”和“2.3.1”项下色谱条件进样测定绿原酸和梓醇的含量，结果见表3。

表3 样品中绿原酸和梓醇的含量检测结果(n=3)

3 讨论

3.1 洗脱条件的选择

检测绿原酸时[14-16]，实验前期分别考察了不同流动相体系(甲醇-水、乙腈-水和乙腈-0.4%磷酸溶液)对色谱峰的影响，发现色谱峰的峰形效果较好时流动相为乙腈-0.4%磷酸。当采用乙腈-0.4%磷酸(V∶V=13∶ 87)为流动相时，tR=8.046 min，但供试品溶液色谱图中绿原酸与其相邻成分无法分离；减少乙腈比例，即乙腈-0.4%磷酸(V∶V=10∶ 90)，发现供试品色谱图中绿原酸与相邻峰分离很好，但tR=13.675 min，保留时间较长。最终确定乙腈-0.4%磷酸(V∶V=11∶ 89)为流动相时，供试品色谱图中绿原酸与相邻峰达到有效分离，保留时间适宜(tR=11.220 min)，方法学试验结果良好。检测梓醇时[17-18]，实验前期比较了甲醇-水，乙腈-水，乙腈-0.4%、0.1%磷酸等不同流动相体系，发现色谱峰的分离效果较好时流动相为乙腈-0.1%磷酸。当调节流动相乙腈-0.1%磷酸的比例为V∶V=0.8∶ 99.2，结果梓醇的tR=10.125 min，与前后杂质峰分离良好，但供试品中杂质峰较多，洗脱时间较长，故等度洗脱15 min后，改为梯度洗脱，增加乙腈比例，供试品溶液中多种成分被洗脱干净。

3.2 供试品溶液制备超声时间的选择

参考文献[14-16]，绿原酸超声溶剂选择50%甲醇30 mL，分别超声处理15、30和45 min，测定结果发现超声30 min即可将有效成分溶解完全，满足样品的分析。而在梓醇测定时发现[17-18]，取“2.3.2”项下供试品溶液超声30 min可将有效成分完全溶解，因此，均选定超声时间为30 min。

3.3 结果分析

加味四妙勇安汤方中金银花味甘，性寒，归肺、心、胃经，为清热解毒之良药，为方中君药；玄参、地黄，甘润之品，泻火解毒，养阴凉血，一可加强君药清热解毒之力，二可凉血养阴，二者共为臣药；再配伍活血散淤之当归、丹参，能活血通络、化瘀止痛，共为方中佐药。另外，绿原酸具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、降血脂、降血糖和免疫调节等作用[19-20]；梓醇是中药地黄的有效成分，具有降血糖、调血脂及神经细胞保护等多方面的药理作用[8]。因此，结合方解及主要成分的药理作用，将方中君药金银花中的主要成分绿原酸和臣药地黄中主要成分梓醇作为质量控制的指标。本实验制备的加味四妙勇安汤的3批提取物中，绿原酸的平均含量为(2.37±0.04)mg/g，RSD为1.48%；梓醇的平均含量为(0.891 3±0.010 3)mg/g，RSD为1.15%。且研究结果表明，采用RP-HPLC法测定加味四妙勇安汤中绿原酸和梓醇的含量，方法稳定，重复性好，结果可靠，该方法可用于控制加味四妙勇安汤提取工艺及提取物的质量。