绿豆资源萌发期抗旱指标筛选及抗旱性鉴定

张思雨，郭亚宁，艾 静，张盼盼，王富刚

（榆林学院 生命科学学院，陕西 榆林 719000）

绿豆（Vigna radiata（L.）Wilczek）作为我国主要的食用豆之一，其籽粒富含蛋白质、脂肪和抗氧化物质等[1-2]，且生育期短、抗逆性强，是重要的药食同源作物[3-4]。陕北榆林地处毛乌素沙地南缘，接壤黄土高原[5]，土壤沙质，光照充足，昼夜温差大，是绿豆的优势产区[6-8]。

榆林市横山区的横山大明绿豆，因籽粒饱满、色泽鲜亮、营养含量丰富，畅销日本、韩国等地，是我国的地标作物[9]。榆林地区属于温带季风气候，雨热同季，春季降雨量少，绿豆在榆林地区5月中下旬种植，降雨量少导致绿豆出苗困难，严重影响当地绿豆产业的发展。因此，在发芽期进行绿豆资源的抗旱性鉴定，对于当地的绿豆产业发展意义深远。

以PEG 6000（聚乙二醇）高渗溶液模拟干旱胁迫条件是目前常用方法之一[10-11]，在各种作物中使用普遍[12-16]。干旱处理发芽期种子，会导致种子在形态、生理和分子方面均发生变化。形态方面研究较多的指标包括发芽势[17]、发芽率[18]、发芽指数[19]、抗旱系数、胚根长度、胚芽长度、干物质等，干旱胁迫导致种子发芽受到抑制，发芽率和发芽势下降，胚根伸长受阻，不能有效吸收水分，胚芽发育缓慢[20]。生理指标方面测定的指标包括脯氨酸含量、丙二醛（Malonodialdehyde，MDA）、可溶性蛋白、过氧化物酶（Peroxidase，POD）活力、过氧化氢酶（Catalase，CAT）和超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）等[21]。

干旱胁迫引起细胞膜的渗透势变化，细胞内发生一系列抗氧化反应，过氧化物在胞内累积，抗氧化酶活力增强[22]。因此，通过形态指标和生理指标综合评价绿豆资源的抗旱性，对于绿豆的抗旱性鉴定具有实践意义。

本研究利用15% PEG 6000模拟干旱胁迫条件，基于40份绿豆资源，测定不同绿豆资源的形态指标和生理指标，通过变异系数分析、相关性分析、隶属函数分析、生理指标分析和聚类分析等，构建40份绿豆资源的抗旱性评价指标体系，以筛选出抗旱绿豆资源，旨在为榆林绿豆的抗旱性育种奠定理论基础和资源基础。

1 材料和方法

1.1 材料

本研究选取40份绿豆资源作为材料，按照顺序编码为 LD01～LD40（表 1），其中，LD01～LD39为全国各地主栽绿豆品种，由西北农林科技大学小杂粮研究团队提供；LD40为榆林地区主栽绿豆品种榆绿1号，榆绿1号由榆林市农技推广中心提供。

表1 供试绿豆的编号及来源Tab.1 Codes and sources of different mung beans

1.2 试验方法

利用15% PEG 6000模拟干旱胁迫条件[23]，选取健康、饱满的绿豆籽粒，清洗干净后晾干，0.5%的次氯酸钠灭菌7 min，蒸馏水清洗干净，滤纸吸干水分，晾24 h后备用。取干净的培养皿，称质量后标记质量，每个培养皿中放入直径11 cm的干净滤纸，均匀摆放绿豆籽粒30粒。各资源设置处理和对照，处理取10 mL 15% PEG 6000溶液，对照取10 mL纯净水，分别倒入培养皿中，称质量并标记质量和资源编号。将所有培养皿置于培养箱中，设置恒温25 ℃，黑暗条件下培养6 d。每个资源设置3个重复。

1.3 形态指标及生理指标测定

以胚根长度≥种子长度为发芽标记，每日定时记录发芽种子数，并根据质量差称质量进行补水。6 d后，随机选取10粒，测定鲜质量、根长、MDA和可溶性蛋白含量，计算相对发芽势（Relative germination potential，RGP）、相对发芽率（Relative germination rate，RGR）、相对发芽指数（Relative germination index，RGI）和相对活力指数（Relative vitality index，RVI）[24-25]。可溶性蛋白含量测定参照文献[26]的方法进行，MDA含量测定参照文献[27]的方法进行。

1.4 抗旱性综合评价

参照郝俊峰等[28]的方法，采用模糊数学隶属函数法对40份绿豆资源进行抗旱性综合评价。

式中，Xj代表某一指标的隶属函数值，X代表某一指标的测定值；Xmax和Xmin分别表示该指标的最大值和最小值。

式中，Vj代表某指标的标准差系数代表某一指标的隶属函数平均值；Wj代表某指标的权重系数；D代表某材料所有指标的综合评价值（D值越大，表示抗旱性越强，反之较差）。

1.5 数据处理

利用Excel 2010进行数据整理，计算各形态指标及生理指标的值；通过SPSS 25.0软件进行主成分分析，计算载荷值和方差贡献率等[29]。

2 结果与分析

2.1 绿豆资源抗旱性相关指标的分析

干旱处理6 d后，对40份绿豆资源进行8个抗旱性指标测定，结果如表2所示。

表2 抗旱指标的变异Tab.2 Variation of drought resistant indexes %

从表2可以看出，15% PEG处理6 d后，各绿豆资源的发芽率、发芽势、发芽指数、胚根长度和活力指数均下降，8个抗旱指标的变异系数分布在25%～313%；活力指数反映不同绿豆资源的发芽速度及生长状况[30]，活力指数越大，绿豆资源的抗旱性越强，相对活力指数平均值为12.28%，参照品种榆绿1号的相对活力指数为12.41%，相对活力指数最大值37.11%，最小值0.94%，变异系数为69%，表明干旱处理导致40份绿豆资源的活力指数均下降，不同资源的下降比例丰富度较高，同时40份资源间的相对发芽势变异系数高达69%，发芽势和活力指数可作为40份绿豆资源抗旱性鉴定的指标；MDA作为膜质过氧化产物，过量积累对植物才会造成损伤，干旱处理后，各绿豆资源的相对MDA含量变化差异明显，平均上升至对照的55.84倍，变异系数高达313%，而可溶性蛋白含量在干旱处理后均上升6.25倍，各资源间的变异系数为70%。相对发芽率和相对鲜质量的变异系数分别为25%和30%，变异幅度较小，不是40份绿豆材料抗旱性筛选的最佳指标。发芽势、相对活力指数、MDA和可溶性蛋白含量的变异系数高，说明其是抗旱性筛选的重要指标。

2.2 抗旱性指标的相关性分析

抗旱性指标的相关性分析如表3所示。

表3 抗旱性指标的相关性分析Tab.3 Correlation analysis of drought resistance indexes

为了进一步分析各指标间的关系，对8个指标进行相关性分析，结果如表3所示，相对发芽率与相对发芽指数和相对活力指数之间存在极显著的正相关关系（P＜0.01），说明15% PEG 6000胁迫处理条件下，绿豆资源的发芽率越高，其活力指数和鲜质量越高，发芽状态愈佳；相对活力指数分别与相对发芽指数和相对根长呈极显著的正相关关系（P＜0.01），说明种子活力高，发芽力强的绿豆资源，其根系伸长力较强；可溶性蛋白作为渗透调节物质[31]，干旱胁迫初期，可溶性蛋白大量产生，响应干旱造成的渗透胁迫，可溶性蛋白和相对活力指数存在显著的负相关关系（P＜0.05），抗旱性资源中可溶性蛋白的上升比例小于不抗旱资源，干旱环境会引起芽苗中的可溶性蛋白含量上升，干旱胁迫越严重MDA含量越大。

2.3 40份绿豆资源的抗旱性综合评价

基于相对发芽率、相对发芽势、相对发芽指数、相对胚根长、相对活力指数和相对鲜质量共6个指标，利用隶属函数法，计算40份绿豆资源的抗旱性综合得分D值，结果如表4所示，40份资源的综合得分分布在0.07～0.08，平均值为0.38，变异系数为36%。当地主栽种（LD40）的D值为0.54，资源LD14、LD16和LD28的D值均大于LD40，其中最大值为0.70，最小值为0.59，说明该3份绿豆材料较榆绿1号具有更好的芽期抗旱性，可作为当地抗旱引种的潜在绿豆资源；其余36份绿豆资源的D值均小于LD40，D值的差异性反映了绿豆参试资源抗旱的多样性。

表4 40份绿豆资源的抗旱性综合评价Tab.4 Comprehensive evaluation of drought resistance for 40 mung bean resources

续表4 40份绿豆资源的抗旱性综合评价Tab.4（Continued） Comprehensive evaluation of drought resistance for 40 mung bean resources

2.4 40份资源的抗旱性聚类分析结果

基于6个发芽和根长指标，计算欧氏距离，通过类平均法，对40份资源进行聚类分析，结果如图1所示。

图1 40份绿豆资源的抗旱性聚类分析结果Fig.1 Clustering dendrogram of drought-resistance for 40 mung bean resources

从图1可以看出，40份绿豆资源科可划分为四大类，其中，I类包含20份绿豆资源，主要为敏旱资源；II类由13份绿豆资源构成，主要包含一般抗旱性资源；III类涉及4份绿豆资源，抗旱水平中等；IV类为抗旱性材料，包含LD16、LD28和LD40，其中较对照抗旱性强的LD16和LD28资源均来源于吉林省。

2.5 PEG胁迫对绿豆资源MDA和可溶性蛋白含量的影响

MDA作为膜脂过氧化产物，它的产生还能加剧膜的损伤。因此，在植物衰老生理和抗性生理研究中可通过MDA了解膜脂过氧化的程度，以间接测定膜系统受损程度以及植物的抗逆性，大量积累会对绿豆芽苗造成损伤[32]。15% PEG处理后，各绿豆资源的MDA含量呈现上升趋势，且40份绿豆资源的增长比例差异性显著。从图2可以看出，干旱处理后，LD20的MDA含量显著性上升，增加至对照的1 037倍，LD17的MDA含量上升455倍，其余资源的MDA含量增加量集中在20倍以内。可溶性蛋白是植物应对渗透胁迫的重要调节物质和营养物质[23]，它们的增加和积累能提高细胞的保水能力，对细胞的生命物质以及生物膜起到保护作用，因此，经常用作筛选抗性的指标之一。干旱胁迫6 d后，LD09的可溶性蛋白含量上升至对照的18倍，增幅显著性高于其他资源，LD38的可溶性蛋白含量变化最小，为对照的0.95倍。

图2 PEG处理后40份绿豆资源的MDA和RSP含量Fig.2 MDA and RSP contents of 40 mung bean resources after PEG treatment

3 结论与讨论

干旱胁迫作为旱区绿豆种植的限制因子，利用不同浓度PEG模拟室内干旱处理，成为研究不同绿豆芽期抗旱性的重要方法[13]。发芽势、发芽率、发芽指数、活力指数均体现了种子的活力，种子的质量会直接影响生育期抗旱性，可溶性蛋白的增加能够提高细胞的保水能力，可对细胞的生命物质及生物膜起到保护作用。因此，常作为筛选抗性的指标，丙二醛（MDA）是膜脂过氧化的最终分解产物，MDA从膜上产生的位置释放出后，可以与蛋白质、核酸反应，从而使之丧失功能，还可使纤维素分子间的桥键松弛，或抑制蛋白质的合成。因此，MDA的积累可能对膜和细胞造成一定的伤害。可通过MDA的含量反映膜系统受损程度以及植物的抗逆性。综合这些指标能够对40份绿豆资源做出抗旱性评价。

作物种子萌发期的抗旱性是一个复杂的数量性状，是会受到多种因素的协同作用，作物的单项指标对抗旱性的评价贡献是不同的，鉴于作物抗旱性的复杂度，单一指标不能客观反映各绿豆资源的抗旱性[20,33]，因此，需要结合统计方法来对其抗旱性进行综合性评价。作物抗旱性评价方法常用的隶属函数、主成分分析、聚类分析和灰色关联分析等方法进行综合评价,本研究利用变异系数相关分析, 发现发芽势、相对活力指数、MDA和可溶性蛋白含量可作为萌发期抗旱性鉴定的重要指标。基于6个发芽相关指标进行聚类分析和隶属函数计算，最终得到40份绿豆资源的抗旱性综合排名。各绿豆资源单一指标反映的抗旱性和综合抗旱性差异明显，排名第一的绿豆资源LD28在干旱处理后，发芽率100%，鲜质量0.495 g/粒，均大于对照，但是其胚根长仅占对照的19.84%，说明该资源在15% PEG 6000处理下，胚根伸长受阻，但种子吸水能力加强，根系活力旺盛，隶属函数法得出的抗旱评级与抗旱表型结果基本一致，和聚类分析结果也相对一致，说明利用隶属函数法对多指标进行综合分析，抗旱性鉴定的结果可靠性更高[34]。

大量研究表明，干旱处理后，抗旱植物的MDA含量上升幅度小，不抗旱植物的MDA积累，同时可溶性蛋白在胁迫处理一定阶段大量产生[35-36]。本研究中，绿豆资源LD14、LD16、LD28和LD40的抗旱性最高，除LD16的MDA相对增加43.69倍，其余3份抗旱性资源的MDA含量升幅均在10倍内。LD20的抗旱性综合排名最低，MDA含量上升1 000多倍，但是部分材料的MDA含量变化无明显规律，同时4份抗旱绿豆资源的可溶性蛋白含量相对上升2.68～6.11倍，低于40份绿豆资源的平均值7.25倍，其他材料的可溶性蛋白含量与其抗旱性排名差异较大，该结果可能与胁迫处理的浓度、时间、各绿豆资源的物质产生及积累特性有关。因此，将本研究中的MDA和可溶性蛋白仅单独分析，未合并计算隶属函数值。

本研究结果表明，在15% PEG 6000浓度胁迫下，40份绿豆资源表现的抗旱性差异明显。RGP和RVI的变异系数均达到69%，是发芽指标中筛选抗旱性资源的优良指标。综合RGR、RGP、RGI、RRL、RVI和RFW指标，利用隶属函数法及类平均法系统聚类，以MDA和可溶性蛋白含量变化为辅助指标，最终将40份绿豆资源按照抗旱性不同综合评分，并分为4类，研究结果为绿豆的抗旱性育种奠定了理论和资源基础。