山西省担子菌补记Ⅰ：2个华北地区新记录种

武艳群 ，刘淑琴 ，孟俊龙 ，2，常明昌 ，2，王术荣 ，2

（1.山西农业大学 食品科学与工程学院，山西 太谷 030801；2.山西省食用菌工程技术研究中心，山西 太谷 030801）

从地理上讲，华北地区一般指秦岭—淮河线以北、长城以南的地区。华北地区气候主要是以夏季高温、多雨，冬季寒冷、干燥的温带季风气候为主，年平均气温在 8～13 ℃，年降水量在 400～1 000 mm[1]。华北地区自然植被主要是以辽东栋、洋槐和柏树等植物为代表形成的森林以及酸枣、荆条和茅草等为代表的灌木草原为主[2]。山西省位于华北地区西部的黄土高原上，黄河中游的东岸。山西省境内多山，有东部太行山，西部吕梁山，北部恒山、五台山，南部中条山和中部的太岳山等[3]山脉。山西植被主要有温带草原和暖温带夏绿阔叶林2个植被地带[4]。在我国华北地区独特而优厚的自然环境中，大型真菌的种类和资源极其丰富，在大型真菌资源的利用上蕴藏着很大的潜力。

近些年来，在山西省发现报道了一批大型真菌的我国新记录种和山西省新记录种。2018年刘虹等[5]鉴定并分析了山西吕梁山脉的一种著名野生食用蘑菇，确定了其为山西省新记录种，并将其命名为红银盘漏斗伞（Infundibulicybe hongyinpanL. Fan &H. Liu）；2019年8月，刘虹等[6]在研究考察山西毒蘑菇资源时，在中条山地区栎树林内地上采到一些黄色的鹅膏属物种标本，经鉴定其为黄盖鹅膏菌，并将其报道为山西省新记录种。2020年，刘洋等[7]在历山发现了山西省新记录物种碱紫漏斗杯伞（Infundibulicybe alkaliviolascens（Bellù） Bellù）。2020年，王术荣等[8]在吕梁市庞泉沟自然保护区内采集到一个白鳞伞属的物种，经鉴定该物种为华美白鳞伞（Leucopholiota decorosa（Peck） O.K. Mill.，T. J. Volk &Bessette），并报道为我国白鳞伞属的一个新记录种。

笔者在对2017—2020年采自历山和吕梁山脉的大型真菌进行详细的形态学和分子生物学鉴定，通过详细的形态学描述和分子系统发育分析再次证明该地区大型真菌物种丰富度极高，旨在为后续的驯化等研究提供科学资料，对华北地区大型真菌物种资源的补充具有重要意义。

1 材料和方法

1.1 试验材料

3份供试材料分别是采集于山西省吕梁山国家自然保护区和历山的大型真菌标本（标本号分别为HMSAU15012、HMSAU15014和 HMSAU15015）。目前，标本被储存于山西农业大学的菌物标本馆（HMSAU）。

1.2 设备与试剂

冷冻高速离心机（Thermo赛默飞世尔，ST16 ST16R）；生物安全柜（上海力康，HFsafe-1200LC）；超微量高精度紫外可见光分光光度计（Thermo赛默飞世尔，ND-ONE-W（A30221））；基础电泳仪（北京君意东方，JY300HE）；凝胶成像分析系统（美国伯乐，Universal Hood II）；光学显微镜（日本，Nikon Eclipse Ni-U）；电恒温鼓风干燥箱（博讯实业有限责任公司，GZX-9240MBE型）。

DNA提取试剂盒（美国OMEGA公司，Forensic DNA Kit D3591-02）；焦磷酸钠（MACKLIN，7553-56-2）；2×EasyTaq PCR Super Mix（全式金生物，AS111-11）；Trans2K DNA Marker（全式金生物，BM101）；琼脂糖（上海创赛科技有限公司，CB005-100G）；50×TAE（北京索莱宝科技有限公司，T1060）；DNA回收纯化试剂盒（Omega Bio-Tek公司，Cycle-Pure Kit D6491-01*）；5% KOH（m/V）。

1.3 试验方法

1.3.1 形态学观察 对采集到的新鲜大型真菌标本进行观察，拍照并且详细地记录其在自然环境中的生长状况，包括其菌盖表面颜色、大小、形状以及菌褶颜色和菌柄长度等特征。观察结束后用报纸小心仔细地包裹，并将其带回实验室内，用50 ℃烘干机烘干过夜，装入袋内，再放于标本盒内保存。观察时将干标本切片，使其在5%的KOH溶液中复水，用NikonEclipse Ni-U 光学显微镜对大型真菌的切片进行观察，分别选择不少于20个完整的担子和孢子等显微结构进行测量并记录，计算孢子的长与宽的比值即Q值（Q值反映孢子的形状）并计算其平均值Qavg[9]。

1.3.2 分子系统学分析

1.3.2.1 DNA提取 取5 mg干燥后的子实体标本 ，使 用 E.Z.N.A.®Forensic DNA Kit试 剂 盒（Omega），按照说明书步骤操作，提取DNA。用超微量高精度紫外可见光分光光度计对所提取的DNA进行浓度测定，之后于-20 ℃条件下储存，以便为后续试验做准备。

1.3.2.2 PCR扩增 将所提取的DNA进行浓度稀释，稀释到合适浓度的DNA作为模板，用引物对ITS8-F（5” -AGTCGTAACAAGGTTTCCGTAG GTG-3” ）/LR3（5” -CCGTGTTTCAAGACGGG-3” ）分别作为上游引物和下游引物对ITS区域进行聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）扩增。PCR扩增反应体系为25 μL：引物浓度为5 μmol/L的上、下游引物各 1 μL；DNA模板 2 μL，2×EasyTaq PCR SuperMix（+dye） 11 μL，ddH2O为 10 μL。PCR 扩增程序为：94 ℃，5 min；94 ℃，0.5 min，55 ℃，0.5 min，72 ℃，1 min，35个循环；72 ℃，10 min，4 ℃保存。用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增后的产物，电泳程序为100 V，45 min。

1.3.2.3 PCR产物纯化和DNA测序 将电泳检测结果合格后的PCR产物用E.Z.N.A®Cycle-Pure Kit试剂盒（Omega）进行纯化，纯化后的DNA做好标记，后将其送到上海生工生物工程有限公司进行正向和反向测序[10]。

1.3.2.4 ITS序列处理 用Chromas软件查看测序结果文件，确认测序结果的准确性，后将标本的ITS序列在MEGA X[11-12]软件中进行复检，经人工修正，排除程序误读，舍弃不理想的序列数据。利用NCBI数据库中的BLAST工具，对所得序列进行同源性比对，确定其所在属，并且从GenBank中得到该属部分物种的基因组序列，同时选择合适的其他属物种的序列作为外类群，用MEGA X软件中Clustal W程序对下载的序列进行校对和序列长度处理。然后进行模型选择，选择最佳模型，最后采用最大似然法[13]（Maximum Likelihood Method，ML），自举值1 000次重建ML系统发育树。用于分子系统发育分析的序列信息如表1所示。

表1 用于分子系统发育分析的序列信息Tab.1 Information of sequences used in the molecular phylogenetic analysis

2 结果与分析

2.1 灰小包脚菇 Volvariella murinella(Quél.) M.M. Moser ex Dennis，P.D. Orton & Hora

标本号：HMSAU15013、HMSAU15014；采集人：王术荣、何轶榕；采集时间：2020年8月31日；采集地点：山西省中阳县上顶山；经纬度：北纬39°7′35″，东经 113°32′46″；海拔：2 050 m。

2.1.1 分子系统发育分析 通过人工复检得到的碱基序列在NCBI数据库中进行比对，结果表明，这 2份 标 本（HMSAU15013、HMSAU15014）的ITS 区序列与Volvariella murinella（OM214459）的序列相似度为97.2%。从NCBI数据库下载部分该属Volvariella的其他物种的基因序列，选用Cantharocybe gruberi（JN006422）作外类群[20]，建立系统发育树（图1），结果表明，本研究的2份标本HMSAU15013、HMSAU15014与其他灰小包脚菇Volvariella murinella（OM214459、MK412361）聚集于同一分支，且支持率为91%，说明标本HMSAU15013、HMSAU15014为灰小包脚菇（Volvariella murinella）。

图1 基于ITS基因的最大似然分析（ML）获得的灰小包脚菇与其相关物种的系统发育树Fig.1 The phylogenetic tree of Volvariella murinella and related species obtained by maximum likelihood analysis of ITS gene region

2.1.2 形态学分析 宏观特征（图2）：子实体偏小。菌盖直径2.2～3.5 cm，呈钝圆锥状，菌盖中部稍微突出，不黏，表面具有辐射状灰色纤毛，白色至灰白色，中央米黄色至淡棕色，边缘完整。菌肉薄，白色，气味和味道不特殊。菌褶离生，稀疏，不等长，淡粉色，边缘完整或略有锯齿状。菌柄中生，2.1～3.2 cm×0.3～0.4 cm，近圆柱形，基部近棒状，白色，表面光洁或具有纵向纤毛，实心，较脆。菌托膜质，白色至淡灰色，不易脱落，开裂成2～3瓣。

图2 灰小包脚菇子实体的形态特征Fig.2 Morphological characteristics of Volvariella murinella fruiting body

微观特征（图 3）：担孢子 6.1～7.9 μm×4.2～4.9 μm，Q 值为 1.3～1.8，Qavg为 1.5，不规则椭圆形或卵圆形，淡黄褐色，孢子壁光滑，较厚。担子18.9～36.3 μm×6.8～10.4 μm，Q值为 1.9～3.9，Qavg为 2.6，棍棒状，光滑，透明。侧生囊状体42.2～57.9 μm×16.3～18.1 μm，近棒状或近纺锤形，壁薄，无色。褶缘囊状体 22.5～39.5 μm×11.3～13.2 μm，形状多样，棒状、宽棒状至近纺锤形，壁薄，无色。无锁状联合。

图3 灰小包脚菇的微观结构Fig.3 Microscopic structure of Volvariella murinella

生境：夏秋季单生或群生于阔叶林的枯枝、落叶上。分布：亚洲（中国山东）；欧洲（德国）[21]。

该种主要识别特征为担子果小型至中型；菌盖表面具辐射状细微纤毛，白色，中央淡米黄色；菌柄色同盖，光洁或具有纵向纤毛。在宏观形态上，研究标本与模式标本相比较，除菌盖直径较模式标本（2.0～5.0 cm）略短外，其他宏观特征均相似。在微观形态上，研究标本和模式标本孢子的颜色和形状极为接近，研究标本的担子比模式标本的担子（大小为 20.0～28.0 μm×6.0～10.0 μm）较长，这可能与测量误差或环境因子有关。通过形态学和系统发育树的构建，确定其为华北地区的新记录种灰小包脚菇（Volvariella murinella）。在生境上，本研究标本采自阔叶树的枯枝落枝，模式种采自林中或林缘的草丛、枯枝落叶层[22]。此物种味道辛辣至略苦[23]，食用价值尚不明胡。

2.2 东方球果伞Strobilurus orientalis Zhu L.Yang & J. Qin

标本号：HMSAU15012；采集人：王术荣、原渊；采集时间：2018年7月24日；采集地点：山西省晋城市沁水县中村镇下川村；经纬度：北纬35°26′32.96″，东经 112°01′10.67″；海拔：1 578 m。2.2.1 分子系统发育分析 将得到的碱基序列进行人工复检后，在NCBI数据库中进行比对发现该标本（HMSAU15012）的ITS区序列与Strobilurus orientalis（MF063170）的序列相似度为100%。从NCBI数据库下载该属Strobilurus的其他8条基因序列，选用Xerula strigosa（LK932286）作外类群[9,11]，建立系统发育树（图4），结果表明，标本HMSAU15012与其他东方球果伞（MF063170、MF063157）聚集于同一分支，且支持率为95%，说明标本HMSAU15012为东方球果伞（Strobilurus orientalis）。

图4 基于ITS基因的最大似然分析（ML）获得的东方球果伞与其相关物种的系统发育树Fig.4 The phylogenetic tree of Strobilurus orientalis and related species obtained by maximum likelihood analysis of ITS gene region

2.2.2 形态学分析 宏观特征(图5)：菌盖直径为1.5～3.5 cm，锥形或伞形，浅褐色。菌褶直生近离生，不等长，灰白色，较密。菌肉薄。菌柄长3.0～5.5 cm，粗0.1～0.4 cm，圆柱状，颜色不均匀，近菌盖处为白色，向下为黄褐色。

图5 东方球果伞子实体的形态特征Fig.5 Morphological characteristics of Strobilurus orientalis fruiting body

微观特征（图 6）：孢子 6.7～8.9 μm×5.3～6.8 μm，Q 值为 1.3～1.7，Qavg为 1.42，窄椭圆形，黄褐色，光滑。担子37.5～43.9 μm×8.2～10.9 μm，Q值为3.4～5.6，Qavg为4.5，棒状，透明，光滑；壁薄，有2～4个担子小梗。侧生囊状体16.2～37.8 μm×6.9～10.8 μm，纺锤形，壁薄或者略厚，透明。褶缘囊状体 14.5～36.2 μm×7.2～12.3 μm，纺锤形，形状类似于侧囊体，通常壁较薄，偶然厚。无锁状联合。

图6 东方球果伞的微观结构Fig.6 Microscopic structure of Strobilurus orientalis

生境：夏季和秋季单生于云杉林中。分布：中国的云南、四川等地。

该种的主要特征为子实体较小，担孢子也较小。在宏观形态上，研究标本菌柄较模式标本（2.0～7.0 cm）略短，其他宏观特征均相似，仅有极小的差异。在微观形态上，研究标本和模式标本极为接近，研究标本的孢子比模式标本的孢子（大小为3.5～6.0 μm×2.0～4.0 μm）较大，这可能与测量误差或环境因子有关。通过形态学和系统发育树的构建，确定其为华北地区的新记录种东方球果伞（Strobilurus orientalis）。在生境上，本研究标本采自云杉林中的落叶落枝上，模式种采自华山松的松果下[14]。此物种味道温和[14]，食药用价值尚不明确。

3 结论与讨论

本研究通过对采集到的3份标本分别进行形态学观察和建立系统发育树分析，鉴定出其物种名称分别为灰小包脚菇（Volvariella murinella）和东方球果伞（Strobilurus orientalis）。

灰小包脚菇（Volvariella murinella）隶属于担子菌门（Basidiomycota）伞菌纲（Agariciomycetes）伞菌目（Agaricales）小包脚菇属（Volvariella）。王建瑞等[24]在山东省鲁中南山地丘陵麻栎林、落叶阔叶杂木林、油松和侧柏疏林植被类型区采集到该物种；冶晓燕[25]在甘肃文县某林中及边缘落叶、草地上采集到该物种并将其报道为甘肃省新记录种；本研究在吕梁山自然保护区采集的灰小包脚菇生长在阔叶林的落枝上，此后我国尚未有该物种的其他报道，需要更多研究来对该物种的分布及生境做补充。

东方球果伞（Strobilurus orientalis）的主要特征为担孢子小，光滑，椭圆形，侧生囊状体壁厚。QIN等[14]在四川和昆明的云杉林中发现过此物种，此后未见有其他报道。本研究在历山自然保护区采集到的东方球果伞也生长在云杉林中。目前该物种仅在我国西南地区的四川、云南和华北地区的山西省被发现，该物种其他分布地的发现尚需更多研究。

本研究报道的2种大型真菌均首次在华北地区的山西省被发现，属于华北地区新记录种。由此可见，该地区大型真菌物种丰富度极高，在大型真菌资源利用方面蕴藏着很大的潜力。本研究对华北地区大型真菌资源物种作了重要补充，为后续的驯化等研究提供了科学资料。