肺癌组织样本和血液样本EGFR基因检测对比研究

邓会岩，刘 畅，贾 迎，李 芳，尹丹静，檀紫瑞，苏 冰，刘月平，*

(1.河北医科大学第四医院病理科，河北石家庄 050011；2.河北医科大学第四医院胸外科，河北 石家庄 050011；3.河北省宁晋县妇幼保健院，河北 邢台 055550)

目前，肺癌的发病率和死亡率在全球范围内的肿瘤疾病中居首位，且发病率仍有逐年上升的趋势，我国亦不例外，全球癌症数据表明，肺癌导致的死亡占总体癌症死亡人数的18.0%[1-2]。非小细胞肺癌(nonsmall cell lung cancer，NSCLC)约占肺癌总数的85%，大多数NSCLC患者发现时即为晚期或已出现转移。近年来，肺腺癌发病率已超过鳞状细胞癌[3]。放化疗是最常用于局部晚期或晚期NSCLC 的治疗方法，它可以一定程度地改善症状、延长生存期，但存在肿瘤进展快、药物副作用大等缺点。随着目前分子检测技术的广泛开展，肿瘤的分子生物学检测和靶向治疗为患者提供了新的治疗策略。

NSCLC 中表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)基因突变的发现引导了一种新的治疗模式[4]。针对有EGFR基因突变的肺腺癌患者，诊断、治疗和临床预后有别于非EGFR基因突变的患者，EGFR基因突变患者进行酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors，TKIs)治疗，对于延长患者生存期及改善患者生存质量都具有显著的指导意义[5]。组织活检是进行EGFR基因检测的金标准，可进一步提供有关肿瘤遗传特征的信息，有助于确定可接受治疗的患者[6]。然而，临床上组织样本取材困难，二次取材活检更是无法实现[7]。此时，外周血及胸水是一种存在于实性肿瘤组织外，可用于EGFR基因检测的肿瘤成分。外周血循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)可提供与侵入性肿瘤活检组织相似的分子遗传信息，通常被称为“液体活检”，可用于疗效监测、早期辅助诊断及肿瘤进展与不良预后的早期预警[8]。除此之外，联合胸水及胸水沉渣细胞检测已成为检测NSCLC 患者EGFR突变的几种新的、有前景且侵入性较小的补充方式，均是目前临床常用的检测手段。

本研究回顾分析收治的175 例肺腺癌患者，均为Ⅲ和Ⅳ期患者病例，所有病例均通过突变扩增系统(amplification refractory mutation system，ARMS)-聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)方法进行了EGFR基因突变检测，并对比不同样本间的检测结果。为进一步提升肺腺癌患者的EGFR突变检出率，更多地筛选出适合靶向治疗的患者提供了依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

收集2016年7月—2017年12月在河北省肿瘤医院呼吸内科和肿瘤内科收治的Ⅲ~Ⅳ期肺腺癌住院和门诊病例175 例，本研究所有病例均取得患者知情同意及通过伦理审查(2020KY314)。所有患者均经病理证实为肺腺癌(131例患者经组织病理证实为肺腺癌，其中119 例患者经组织活检样本证实，12 例患者经胸水沉渣细胞样本证实，44例患者经气管镜刷片细胞病理证实)。175 例均有血浆样本，其中119 例同时有活检组织样本，12例同时有胸水沉渣细胞样本。男48例，女127 例，年龄39~82 岁，平均年龄63 岁，中位年龄54岁。临床分期Ⅲ期74例，Ⅳ期101例。

1.2 试剂与仪器

核酸提取试剂盒、EGFR基因突变检测试剂盒和荧光定量PCR仪均购于美国罗氏公司。其他主要仪器包括赛默飞Biofuge Primor 低温离心机，蔡司Scope A.1光学显微镜。

1.3 血浆标本采集与血浆游离DNA提取、扩增

经静脉采集患者外周血液5 mL，置入EDTA抗凝离心管，按照核酸提取试剂盒操作说明提取游离DNA(cell-free DNA，cfDNA)，提取完毕后测定DNA 浓度，并以此cfDNA 为模板，按EGFR基因突变检测试剂盒说明书进行EGFR基因19~21外显子突变检测。

1.4 肺癌组织标本DNA提取与扩增

肺癌活检组织样本和胸水沉渣细胞样本均进行福尔马林固定石蜡包埋(formalin-fixed paraffinembedding，FFPE)，经诊断确诊后，将FFPE 组织按照5 μm 厚度连续切片10张，并将切取的组织片置于1.5 mL有盖无菌微量离心管中，按照核酸提取试剂盒操作说明提取DNA(脱蜡、消化裂解、吸附核酸、洗涤纯化、洗脱DNA)，提取完毕后测定DNA 浓度，并以肺癌组织样本基因组DNA为模板，后续提取与扩增过程同步骤1.3。

1.5 胸水沉渣细胞样本DNA提取与扩增

胸腔积液脱落细胞学病理证实为腺癌的患者，另取积液1.5 mL 置于有盖无菌微量离心管中，室温10 000 r/min 离心3 min，弃上清。向沉淀中加入1 mL 1×PBS混匀后室温10 000 r/min离心3 min，弃上清，获得最终细胞沉淀，并制作成FFPE 样本块，后续提取与扩增过程同步骤1.4。若收集的细胞沉淀中有大量的红细胞残留，可加红细胞裂解液混匀后，室温放置5 min，10 000 r/min 离心3 min，弃上清，收集细胞沉淀，可重复几次直至红细胞去除干净。

1.6 随 访

所有患者进行电话方式随访，随访截至2018 年5月31 日，失联病例计为失访，共73 例失访病例。总生存时间为从确诊到死亡或末次随访时间，以月为单位。中位随访时间13个月。

1.7 统计学方法

采用SPSS 22.0对数据进行统计学分析，患者不同临床病理指标组患者血液EGFR突变率的差异采用卡方检验，血液样本和组织样本EGFR突变率的比较采用Fisher精确概率法，将卡方检验中与EGFR突变相关的诸因素纳入Cox 回归进行患者临床病理指标与生存时间之间的多因素分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 NSCLC患者临床病理特征

175 例患者均为晚期肺癌患者，均进行ctDNAEGFR突变检测，检测成功率为100%(175/175)。119例患者同时进行组织活检样本EGFR基因检测，12 例患者同时进行胸水沉渣细胞样本EGFR基因检测，但样本检测成功率为96.9%(127/131)，失败样本均为胸水沉渣细胞样本，其中1 例为样本DNA 质量差，3 例为提取样本DNA浓度<2 ng/μL，低于上样浓度。不管是血液样本还是组织样本，EGFR突变均以Exon19 del 和Exon21 L858R 为主，两者突变率的总和分别占血液样本和组织样本总突变率的83.0%和81.7%，不同样本间EGFR突变分布见表1。48 例无组织样本或组织样本检测不成功的患者中，其中10 例血液样本EGFR检测为阳性。在175 例晚期非小细胞肺癌患者中，59/175 例(33.7%)存在血液样本EGFR检测阳性，60/127 例(47.2%)存在组织样本EGFR突变阳性。晚期非小细胞肺癌EGFR突变在不同的性别(χ2=3.451，P=0.045)、 肿 瘤 直 径 (χ2=8.911，P=0.002)、 T 分 期 (χ2=17.567，P=0.000)、 淋 巴 结 转 移 (χ2=18.511，P=0.000)、转移站数(χ2=3.341，P=0.047)和远处转移(χ2=10.874，P=0.001)的分组间的差异有统计学意义。各临床病理指标与EGFR突变之间的关系见表2。

表1 不同样本间EGFR突变分布[百分率(各位点阳性例数/总阳性例数)]

表2 175例肺腺癌患者临床病理特征及与血液样本EGFR突变关系

2.2 血液样本与组织样本EGFR突变对比分析

127 例患者同时进行了肺癌血液样本和组织样本EGFR检测，通过表1中对比血液样本和组织样本检测EGFR突变状态总体一致性为85.0%(108/127)，即45例患者血浆EGFR检测与组织样本EGFR检测结果均为EGFR检测阳性；而63 例患者两种样本EGFR检测均为阴性。4 例患者仅在血液EGFR检测中为阳性；15例患者仅在组织样本EGFR检测中为阳性。未经组织检测或组织检测不成功的48 例患者中，经血液EGFR检测，10 例患者为阳性，其余均为阴性。采用Fisher精确概率法将血液和组织两组样本EGFR突变率进行比较，差异有统计学意义(P=0.000)。各组间的突变率见表3。

表3 血液样本和组织样本EGFR突变率对比

2.3 生存分析

血浆DNA 中存在EGFR检测阳性的患者，其无进展生存期比阴性的患者更长。EGFR检测阳性患者中位无进展生存期为5.7个月，而EGFR检测阴性患者中位无进展生存期为 2.8 个月(χ2=8.943，P<0.05)。在患者临床病理指标与生存时间的分析中，肿瘤直径[95%CI(0.151， 0.725)，P=0.006]、 淋 巴 结 转 移 [95%CI(0.180， 0.865)，P=0.020]、 远 处 转 移 [95%CI(0.097，0.612)，P=0.003]均是影响患者无进展生存期的重要因素。各组间的生存期分析见表4。

表4 患者临床病理指标与生存时间的多因素分析结果

3 讨 论

EGFR信号通路作为肿瘤发生发展过程中发挥重要作用的通路之一，在调节细胞分裂、活化、凋亡等多种生物学事件中起到关键作用。异常的EGFR基因活化，可以抑制肿瘤细胞凋亡，促进细胞增殖、分化、迁移，甚至新生血管生成[9]。我国晚期肺腺癌EGFR基因阳性率在40%~60%之间，在当今精准化医疗的时代，EGFR突变阳性对于晚期肺癌患者来说意义重大。目前，此类患者可采用基于EGFR基因的靶向药物如厄洛替尼(erlotinib)、吉非替尼(gifitinib)和奥沙替尼(osimertinib)进行治疗。但靶向药物的应用、疗效以及是否存在耐药均需要通过评估EGFR基因突变状态来实现。因此，如何选取检测样本，以及如何采用灵敏度高、准确性好的检测方法将此类患者检测出基因变异，从而筛选出可用药患者是当今精准治疗的重中之重。

研究显示[10]，大部分晚期NSCLC 患者的血液中存在循环游离DNA(cell free DNA，cfDNA)。cfDNA主要来源于凋亡或坏死的细胞，包括正常细胞和肿瘤细胞，如果来自肿瘤细胞称为ctDNA。血液游离DNA片段通常较短，在晚期癌症患者血液中浓度极低，平均约为17 μg/L。既往系列研究已经在NSCLC 患者的血浆或血清样本ctDNA 中发现EGFR基因突变，初步显示外周血ctDNAEGFR基因突变检测及对EGFR-TKIs疗效预测的可行性[10-11]。此外，NSCLC 患者在TKI 治疗过程中会发生耐药，甚至有文献报道过多次药物敏感、耐药交替出现[10-11]。因此，在肿瘤不同时期、治疗的不同阶段利用便捷的血液EGFR基因检测，动态监测EGFR突变状态，调整治疗方案，合适的时间将合适药物用在合适的患者身上，实现精准医疗。

国内部分专家曾就检测EGFR基因突变的规范提出了建议[12]。建议指出肺癌组织样本如手术标本、活检标本、胸水沉渣细胞标本和血液标本均是晚期NSCLCEGFR突变状态检测可选择的样本[13-14]。本研究比较了血液样本和肺癌组织样本EGFR基因突变的异同，结果显示了肺癌组织样本和血液样本的EGFR基因检测结果存在小部分病例间的差异，且肺癌组织样本的阳性率高于血液，以及存在单纯血液样本EGFR为突变型而肺癌组织样本为野生型的病例，这些差异可能反映了血液DNA检测技术的局限性和肿瘤内的异质性，同样也可能预示了对化疗/靶向治疗的敏感性差异。但尽管这种异质性在许多癌症尤其是在非小细胞肺癌中是已知的，但一个临床决定通常仅基于一次活检，由于血液反映了整个连续的肿瘤负荷，因此，使用血浆DNA 进行EGFR突变检测可能更为准确并且信息量大。在肺癌组织样本中，除了纳入活检组织样本，本研究还纳入了胸水沉渣细胞样本，此类样本在临床工作中同样为常见样本，本组12例胸水沉渣样本EGFR突变率为37.5%，虽然阳性率略低于活检组织样本和血液样本，但是无疑是一种行之有效的检测手段，在活检组织样本取材困难且存在大量癌性胸水的病例中，采用胸水沉渣细胞进行EGFR基因检测是一种很好的检测方法。此类样本除满足临床诊断的需求外，在进行EGFR基因检测时同样会面临样本量不足、处理不良导致DNA 降解等问题，本组12 例胸水沉渣样本中4 例检测失败，其中1 例为样本DNA 质量差，3 例为提取样本DNA 浓度低于上样浓度，此类问题虽然在本组研究中均出现在胸水沉渣样本中，但在其他样本中同样常见，应尽可能地避免此类问题的出现，进而提升EGFR突变检出率。

众所周知，在TKIs治疗的患者中，在预处理标本中不能检测到的引起TKI 抗性的突变可能会在患者中复发，如T790M突变，T790M突变是EGFR-TKIs治疗过程中最常见的耐药突变。AURA 研究显示，osimertinib 对血浆中T790M 阳性和在活检组织中T790M阴性患者的疗效低于T790M组织检测阳性的患者。目前的临床实践表明[15]，由于T790M 在肿瘤组织中存在异质性，因此需要在复发部位进行再次活检以预测osimertinib 的治疗效果。总之，血液标本和组织标本互为补充，在组织标本EGFR检测为野生型时，或者无法获得组织样本时，均有必要对血液标本进行EGFR检测，以提高EGFR基因的检出率，扩大TKIs适用人群。

Thress 等[16]报道，胸外转移性患者比胸腔内转移患者的血浆中更容易检测到EGFR基因突变，且EGFR阳性组出现转移的数量明显高于阴性组。这表明肿瘤转移状态可能影响血浆中EGFR是否突变，需在临床工作中进一步验证，此研究结果与我们的研究结果一致，且除了肿瘤转移状态如淋巴结转移、远处器官转移等，女性患者、肿瘤直径≥3 cm等也均是影响血液EGFR基因突变检出率的重要因素。

本研究应用肺癌组织样本检测和血液样本检测的方法进一步证实了血浆中EGFR突变检测的可行性，但基于样本量小，有待收集更多的病例阐明血浆样本可以和肿瘤组织样本EGFR检测中发挥同等效用，甚至是在将来可以代替活检组织样本检测EGFR突变。此外，血浆EGFR动态监测可以帮助临床医生为患者选择最佳治疗时机，不同样本同时进行检测有助于提高检出率，扩大受益人群。