二甲双胍对镉诱导小鼠急性肝毒性的影响

谭明雪，柳晓玲，姜姝芸，潘心红，陈 雯，陈丽萍，*

(1.中山大学公共卫生学院卫生毒理学系，广东 广州 510080；2.广州市疾病预防与控制中心毒理科，广东 广州 510440)

镉是广泛存在的环境污染物和内分泌干扰物，镉元素一般天然存在于地壳表面，常见工业活动如采矿、制造镍镉电池和电子产品等会让镉元素以污染物的形式释放出来，流入自然环境中。镉可以通过空气、水进入到人体内[1-2]。流行病学研究显示环境镉暴露会导致一系列疾病，比如高血压、Ⅱ型糖尿病、肾功能衰竭和肝脏疾病等[3-4]，特别是肝脏疾病，人群调查显示坏死性肝炎和非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)的发病率与环境镉暴露相关[5]，动物实验也显示镉具有明显的肝脏毒性[6]，因此寻找其防治药物具有重要的公共卫生意义。以往的实验性研究发现植物糖蛋白[7]和腐胺[8]等能在一定程度上缓解镉相关的肝脏疾病，但是否能正式用于临床治疗仍有待研究，因此“老药新用”可能更具有应用前景。

蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A，PP2A)是真核生物中最主要的丝氨酸-苏氨酸蛋白磷酸酶，调控细胞周期、增殖、DNA损伤修复等事件[9]，其活性降低和很多人类疾病的发生发展密切相关[10]。以往研究发现肝细胞PPP2R1A基因(编码PP2A Aα亚基)敲除小鼠出现了肝脂质变性、炎症和肝纤维化的表型[11]，表明PP2A在调控肝脏疾病的发生发展中起着重要作用。进一步研究发现PP2A的活性和特异亚基表达在氯化镉(CdCl2)染毒不同阶段的小鼠肝脏中降低，并和病程相关[12]，提示PP2A活性在CdCl2致肝脏损伤中起作用。既往研究已经证实PP2A是多种疾病的治疗靶点，因此针对PP2A活性的药物开发具有很好的应用前景[13]。二甲双胍(metformin)是目前广泛使用的口服降糖药，也用于肝脏疾病的治疗[14]。研究已证实二甲双胍是PP2A的激动剂，通过靶向PP2Ac-α4-MID1复合物[15-16]激活PP2A酶活性，抑制肿瘤的发生[13]。然而，二甲双胍是否可以缓解CdCl2诱导的肝毒性尚不明确。本研究用二甲双胍干预处理镉染毒的小鼠以及人肝细胞L02，通过检测肝脏病理、血生化、转运蛋白mRNA表达、细胞荧光强度和细胞活力等指标，初步探讨二甲双胍在CdCl2诱导的肝毒性中的作用和可能机制，以期为镉暴露人群的健康防护提供新策略。

1 材料与方法

1.1 材 料

氯化镉、盐酸二甲双胍购于Sigma-Aldrich公司；生化分析试剂盒购于上海复兴长征医学科学有限公司；4%多聚甲醛购于Asegene公司；TRIzol试剂购于Invitrogen公司；逆转录试剂盒购于TaKaRa公司；SYBR Green I荧光染料购于TOYOBO公司。

1.2 方 法

1.2.1 小鼠分组和染毒8周龄雄性野生型(wild type，WT)和纯合子小鼠(PP2A Aα-/-，HO)各24只，随机分为4组，包括对照组(0.9%生理盐水)、镉染毒组(1.5 mg/kg CdCl2)、二甲双胍处理组(100 mg/kg二甲双胍)、镉和二甲双胍联用组(1.5 mg/kg CdCl2，100 mg/kg二甲双胍)。二甲双胍和氯化镉的浓度经预实验摸索和参考文献确定，小鼠经腹腔注射染毒，连续7 d。

1.2.2 内暴露检测对小鼠生物样本(血液、肝脏和肾脏)进行前处理后，待电感耦合等离子体质谱(inductively coupled plasma-mass spectrometry，ICPMS)仪器各项参数稳定，先配置内标应用液与标准曲线溶液，绘制好标准曲线后，检测溶剂对照与样本的重金属含量，最后采集数据。

1.2.3 血生化检测小鼠用1%戊巴比妥钠按10 μL/g进行麻醉，腹腔静脉采血收集到2 mL EDTA抗凝管中。常温下3 500 r/min离心5 min后收集血浆，利用半自动血生化分析仪检测小鼠外周血谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)和 甘 油 三 酯(triglyceride，TG)浓度。

1.2.4 肝脏组织病理学观察小鼠肝组织用4%多聚甲醛固定，并用石蜡包埋切片(厚度4 μm)。经脱蜡、染核、分化、反蓝等步骤后用苏木素-伊红(HE)染色，用油红O试剂盒对肝脏冰冻切片(厚度7 μm)中的脂滴进行染色。病理评分标准参考病理学临床研究委员会提出的非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)组织学特征评分标准[17]。

1.2.5 肝脏组织中转运蛋白的mRNA表达水平检测用TRIzol提取肝脏组织中总RNA；选择20 μL的反应体系合成cDNA；逆转录结束后，将cDNA置于-20℃保存备用；采用SYBR Green染料法进行实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)检测转运蛋白zip14、dmt1、mrp1、oct2、bsep和zip8的mRNA表达水平。

1.2.6 细胞培养人肝永生化细胞株L02来自ATCC细胞库，培养于RPMI-1640完全培养基(含10%胎牛血清)，置于CO2体积分数为5%、37℃恒温箱中培养，待细胞生长至汇合度约为80%时，用0.25%胰蛋白酶消化传代。

1.2.7 CdCl2诱导的细胞毒性检测L02细胞接种24 h后，分为4组，分别为对照组、镉染毒组(0、12.5、25、50和100 μmol/L CdCl2)、CdCl2和1 mmol/L二甲双胍联用组、CdCl2和2 mmol/L二甲双胍联用组。处理细胞24 h后，采用CCK-8试剂盒检测L02细胞活力。

1.2.8 L02细胞钙离子水平测定L02细胞接种24 h后，用CdCl2和/或二甲双胍处理(分组同1.2.7)，然后加入Fluo-4 AM孵育30 min，在荧光显微镜下检测钙离子标志物Fluo-4 AM的荧光强度评估细胞内钙离子水平，判断人肝细胞L02的胞内镉离子水平变化[18]，并采用ImageJ软件对细胞荧光强度进行定量。

1.3 统计学方法

统计分析使用GraphPad Prism 7.0软件。不同组别的病理评分比较使用Mann-Whitney检验，不同组别的内暴露、血生化、甘油三酯指标比较使用Studentst检验，组间的相对细胞活力比较使用one-way ANOVA检验，以α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 PP2A Aα缺失对CdCl2诱导小鼠急性肝毒性的影响

小鼠内暴露检测结果见图1A~C。与各自对照组相比，镉染毒WT小鼠和HO小鼠的血镉分别升高了534.74倍和705.60倍，肝镉分别升高了1 144.46倍和918.05倍，肾镉分别升高了52.86倍和137.07倍，提示镉在小鼠血液、肝脏和肾脏中蓄积，但两种基因型小鼠间的差异无统计学意义。血生化检测结果见图1D~F。镉染毒下，WT和HO小鼠的ALT浓度分别升高86.40%和71.67%，AST浓度分别升高3.19%和48.44%，甘油三酯浓度分别升高了31.70%和62.54%。组织病理学观察结果见图1G，HE染色显示染毒WT小鼠的肝小叶结构紊乱、炎症细胞浸润，而在HO小鼠中更加严重，肝细胞胞浆中可见许多大小不等、边界清晰的脂质空泡。HE染色的病理评分结果见图1H和I，提示HO小鼠肝脏损伤更为严重。油红O染色也显示镉染毒小鼠肝脏出现大量红色脂滴。综合以上结果，表明肝细胞特异性敲除PPP2R1A基因加重了CdCl2诱导的肝脏损伤，PP2A活性对于保护肝脏具有重要作用。

图1 CdCl2暴露诱导小鼠急性肝脏损伤

2.2 二甲双胍可缓解CdCl2 诱导的小鼠肝毒性

以往研究表明二甲双胍是PP2A的激动剂[13]，因此我们拟探讨二甲双胍是否可以缓解CdCl2诱导的肝毒性。血生化结果如图2A所示，镉染毒导致WT小鼠的ALT和AST浓度分别升高了86.40%和3.19%，而二甲双胍处理导致WT染毒小鼠的ALT和AST浓度分别降低了61.14%和44.02%。HE染色的组织病理学观察结果及其病理评分见图2B和2C，二甲双胍和CdCl2联用组小鼠的肝损伤程度降低，可见部分结构正常的肝小叶，肝细胞排列尚整齐，脂质沉积不明显，炎症浸润程度减轻。油红O染色结果见图2C，和单独镉染毒小鼠相比，二甲双胍CdCl2联用小鼠的肝脏红色脂滴减少。血生化结果见图2D，血浆TG浓度降低了43.75%。综合以上结果，表明二甲双胍可减轻CdCl2诱导的肝毒性。

图2 二甲双胍可减轻CdCl2诱导的小鼠肝毒性

2.3 二甲双胍可能通过抑制镉的吸收缓解肝毒性

以往研究发现PP2A通过调控转运蛋白的表达影响化学物的肝毒性[19]，因此我们拟探讨PP2A活性降低是否调控镉的细胞转运从而影响肝毒性。首先检测肝脏中6种转运蛋白的mRNA表达水平。qPCR结果如图3所示，和WT小鼠比，HO小鼠中主要介导镉转运吸收的转运蛋白zip14和dmt1的mRNA水平分别升高了16.48%和53.61%，镉染毒下则分别升高了47.32%和136.23%，而其他转运蛋白mrp1、oct2、bsep和zip8无明显变化，提示zip14和dmt1的诱导表达受PP2A调控。以往研究表明转运蛋白zip14[20]和dmt1[21]主要负责镉的吸收与蓄积，提示PP2A活性降低可能促进肝细胞对镉的吸收，加重肝脏毒性。因此，我们拟探讨PP2A激动剂二甲双胍能否抑制细胞对镉吸收，减轻肝毒性。细胞毒性实验结果见图4，细胞免疫荧光结果见图5。二甲双胍对L02细胞没有明显毒性。镉染毒导致L02的细胞活力降低了45.99%，且细胞荧光强度比对照增加了2.72倍，提示镉离子进入细胞。1和2 mmol/L二甲双胍处理后，细胞活力比单纯CdCl2处理的细胞分别升高了59.28%和89.78%，细胞荧光强度则分别降低了40.77%和54.17%，表明二甲双胍抑制了肝细胞对镉离子的吸收。综合以上结果，表明二甲双胍可能通过抑制镉离子的转运吸收减轻肝细胞毒性。

图3 小鼠肝脏中各转运蛋白的mRNA表达水平(n=6)

图4 二甲双胍可减缓镉的细胞毒性

图5 二甲双胍抑制肝细胞吸收镉离子

3 讨论

镉的生物半衰期长达30年，进入机体后会蓄积在肝脏并引起明显的肝毒性，因此寻找防治药物对于保护人群健康具有重要意义。本研究从PP2A活性降低加重氯化镉诱导的急性肝毒性出发思考，探讨PP2A的激动剂二甲双胍的作用，发现二甲双胍对CdCl2诱导的肝脏损伤具有一定缓解作用，机制研究揭示可能是通过减少镉离子进入肝细胞来实现的，研究结果可为镉的肝毒性防治提供了新策略。

PP2A介导的蛋白质去磷酸化是信号转导通路的重要调控点。以往研究证实了PP2A在细胞响应环境污染物应激中起着重要作用，如PP2A B56α复合物通过调节CYP2E1表达来影响苯的血液毒性[22]，PP2A B56δ全酶调控重金属诱导的热休克蛋白表达[23]或介导MTF-1的去磷酸化参与调节金属硫蛋白的表达，进而影响重金属的细胞毒性[24]。我们前期用CdCl2对小鼠染毒3、6和9个月，发现小鼠肝脏出现进行性炎症、脂肪变性和肝纤维化改变，且PP2A 的活性降低，并和肝脏损伤进程相关[12]。本研究中我们也发现PP2A活性降低加重了氯化镉诱导的肝毒性，提示PP2A 可能是氯化镉产生毒作用的重要调控子。一致的是，以往研究也发现异甘草酸镁可减少镉诱导的ROS生成，激活PP2A，减轻镉诱导的肝细胞凋亡[25]。体外实验也发现镉暴露诱导细胞中miR-133b 表达，但抑制PPP2R2D基因(编码PP2A-B55δ)的表达，导致细胞G2/M 期停滞，细胞增殖受阻[26]。综上所述，PP2A活性对于保护细胞抵抗镉诱导肝脏毒性至关重要。

副作用限制了金属螯合剂在重金属解毒中的应用[27]，人们开始关注一些现有药物的新用途。比如，褪黑素可通过抑制TXNIP-NLRP 炎症小体从而减轻镉诱导的肝损伤[28]，维生素E 通过抑制氧化应激并激活Nrf2通路，在镉诱导的亚慢性肝损伤中发挥着保护作用[29]。二甲双胍是一种目前广泛应用的降糖药物，同时也用于肝脏疾病治疗。研究表明二甲双胍可增加肠道有益菌的丰度，进而改善肝损伤[30]。乳酸受体G 蛋白偶联受体81(GPR81)与脂肪分解有关，对维持肝脏脂质稳态至关重要，研究还发现二甲双胍可靶向GPR81 改善实验性非酒精性脂肪肝[31]。此外，二甲双胍还可通过p-AKT/mTOR/LC-3II 通路减轻NAFLD 大鼠肝损伤[32]，抑制乙醇诱导的甘油三酯积累以及血清中ALT 和AST 的增加，激活LKB1/AMPK/ACC 轴进而抑制酒精性肝病中的脂质形成[33]。斑马鱼模型也发现二甲双胍可特异性影响NAFLD 相关肝细胞癌的进展[34]。二甲双胍证实可改善NASH 模型小鼠的病变程度[35]，提示二甲双胍用于治疗肝脏疾病具有潜在的应用前景。相一致地，本研究也发现二甲双胍改善氯化镉诱导的肝毒性，但对于镉的慢性肝毒性还需进一步研究。

zip14 属于Zn2+转运蛋白，主要在肝脏表达[36]，研究发现其可促进镉的吸收，增加细胞对镉毒性的敏感性[20]。研究发现镉暴露大鼠胎盘中的dmt 和zip14的表达水平上调[37]，流行病学研究也发现高镉暴露女性的胎盘中dmt1 的mRNA 表达增加[38]。在哺乳动物中，Fe2+转运蛋白dmt1 表达在肠上皮细胞，主要参与包括铁和镉在内的多种二价金属离子的摄取[21]。此外，dmt1还在肝、肾和脑中表达，可能和重金属暴露所导致的多种脏器损伤相关[39]。我们以往做了转录组测序也发现dmt 和zip14 表达在PPP2R1A基因敲除小鼠肝脏中有差异[19]，本研究进一步证实了zip14 和dmt1 受PP2A 调控，并可能和PP2A 介导调控镉肝毒性有关。然而，二甲双胍影响了镉离子进入肝细胞，但具体机制不明确，是否通过调控zip14 和dmt1 的表达还需要进一步研究确定。

本研究揭示了二甲双胍可通过减少镉离子进入肝细胞减轻氯化镉诱导的肝脏毒性，提示二甲双胍用于防治镉的肝毒性的应用前景，可作为镉中毒防治的新策略，具有重要的公共卫生意义。然而，也有研究表明二甲双胍具有肝毒性，后续研究应进一步明确二甲双胍缓解镉肝毒性的安全剂量范围。