新疆7地区馕用酸面团微生物多样性分析

于静，许倩，李芬，牛希跃*

（1.阿克苏地区疾病预防控制中心，新疆 阿克苏 843000；2.南疆特色农产品深加工兵团重点实验室，新疆 阿拉尔 843300；3.塔里木大学 食品科学与工程学院，新疆 阿拉尔 843300；4.塔里木大学 分析测试中心，新疆 阿拉尔 843300）

馕在新疆已有两千多年的历史，又称之为“胡饼”、“炉饼”，是新疆维吾尔等少数民族的传统主食之一[1-2]，其在生活中扮演着重要角色，在新疆有“可以一日无菜，但绝不可以一日无馕”的说法[3-5]。近年来，随着活性干酵母被引入我国且被广泛地应用于面制品中，传统酸面团逐渐呈现劣势[6]。但新疆馕中的酵头仍被广泛应用于自治区内各大、中、小城市（镇），主要是由于传统酸面团发酵的馕口感更优，而活性干酵母与传统酸面团相比则口感、风味、香气单一[7-8]。传统酸面团中主要是以酵母菌、乳酸菌为主的多菌种混杂体系[9]，由于各种微生物代谢出不同的物质且相互之间能发生反应，从而来影响面团的风味、口感和感官品质。酵母菌在发酵面团中产生的CO2被面团中的面筋包裹而使面团体积增大，这也是面团疏松多孔的原因；乳酸菌能代谢产生乳酸等多种挥发性酸而使面制品拥有多种风味，并且可以降低面团的pH值，同时产生胞外多糖，能改变食品的流变性。乳酸菌能生成一些抑菌物质如细菌素来抑制面食中致病菌和腐败菌的繁殖，以此来延长货架期[10-12]。这些都是活性干酵母所不具备的，因此传统发酵剂仍然存在于全国各地，其制作的面食仍受广大消费者喜爱。但传统方式制作面制品存在制作工艺粗放、技术落后、培养条件不稳定、贮藏过程变质明显等弊端，主要是因为微生物菌群不同、卫生条件不达标、面团中含有有害菌等[13-15]。

目前只有少部分人研究馕中的微生物，并且是研究馕中的酵母菌，而对馕中微生物的多样性研究相对较少。本文对新疆7个地区馕面团微生物多样性进行研究，不仅为酸面团中微生物的多样性研究提供初步的理论依据，也为后续研究区域性面食提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 样品来源

酸面团样品从新疆采集，共计12份，7个采集地区见表1。

表1 各地区采集的酸面团样品Table 1 The sourdough samples collected from different areas

1.1.2 培养基及主要试剂

酵母膏胨葡萄糖琼脂（yeast extract peptone glucose agar medium，YPD）培养基：固体加2%琼脂、2%蛋白胨、2%葡萄糖、1%酵母膏；WL营养琼脂培养基：青岛日水生物有限公司；MRS培养基：北京奥博星生物技术有限责任公司；革兰氏染色液：珠海贝索生物技术有限公司；引物27f/1492r、NL1/NL4：上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 主要仪器

PHS-3C型pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司；TGL-20bR型高速冷冻离心机：上海安亭科学仪器厂；HJ-4A型数显恒温磁力搅拌器：江苏金怡仪器科技有限公司；HPX-9162MBE型电热恒温培养箱：上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；PowerPac Universal型电泳仪、MYCYCLER型PCR仪及ChemiDoc XRS+型凝胶成像系统（化学发光）：伯乐生命医学产品（上海）有限公司；CX21FS1型生物显微镜：日本奥林巴斯光学工业株式会社。

1.3 方法

1.3.1 样品处理

在无菌室中称取25 g样品于225 mL灭菌生理盐水（0.85%）中，用预先灭菌的磁力搅拌器充分搅拌混匀（干样品则预先用无菌生理盐水浸泡），采用10倍梯度稀释法稀释至10-7，备用。

1.3.2 乳酸菌的分离纯化

样品稀释方法同1.3.1。在无菌环境中，取稀释梯度为10-2～10-4，用灭菌的枪头从每个梯度各吸取100 μL均匀涂布于MRS固体培养基中，在37℃厌氧条件下48 h～72 h培养。在同一个样品不同梯度下挑选出不一样的疑似乳酸菌的菌株接种到液体培养基中，37℃培养24 h～48 h，再进行平板划线纯化，经过数次反复的划线纯化，革兰氏染色、镜检无杂菌为止，再进行过氧化氢酶试验。将革兰氏染色阳性、过氧化氢酶阴性菌初步视为乳酸菌；其余则根据镜检后的形态及颜色另行归类[16]。

1.3.3 酵母菌的分离纯化

选择稀释梯度为10-2～10-4的样液，吸取100 μL均匀涂布于YPD固体培养基中，在28℃下培养48h～72h，在同一个样品不同梯度下挑选出不一样的菌株接种到液体培养基中，在相同温度条件下培养24 h～48 h再进行平板划线纯化，反复多次划线后经镜检无杂菌为止。

1.3.4 酵母菌形态学的初步认定

将1.3.3中获得的纯酵母菌划线接种到WL营养琼脂培养基中，28℃培养5 d～7 d，根据平板上菌落的颜色与形态，来判定酵母菌的类别。

1.3.5 DNA提取与PCR扩增

细菌用十二烷基硫酸钠法，真菌采用冻融法[17]分别提取相应菌株的DNA，并进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增。细菌进行16S rDNA扩增，采用细菌通用引物27f和1492r，PCR反应体系（50 μL）如下：10buffer5.0μL，dNTPs2.0μL，正、反引物各 2.0μL，ExTaq 酶 0.5 μL， 模板 DNA2.0μL，dwater 36.5 μL。 PCR 反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，56℃退火 30 s，72℃延伸 2 min，30个循环；72℃终延伸10 min，4℃保存。真菌进行26S rDNA扩增，采用酵母菌扩增引物NL1和NL4，PCR反应体系（50 μL）如下：10buffer 5.0 μL，dNTPs 4.0 μL，正、反引物各 3.0 μL，ExTaq 酶 0.5 μL，模板 DNA 2.0 μL，dwater 32.5μL。其PCR反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性 30 s，56℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，30个循环；72℃终延伸7 min，4℃保存。

1.3.6 琼脂糖凝胶电泳、DNA测序和构建系统发育树

采用2.0%的琼脂糖凝胶对PCR扩增产物进行检测，合格后测序。细菌和真菌分别登录Ezbiocloud（http：//www.ezbiocloud.net/）和 NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库进行已知序列的同源性比对。

1.4 数据处理与分析

利用MEGA5.05软件进行分析，采用邻近法（Neighbor-Joining）构建系统发育树[16]。

2 结果与讨论

2.1 乳酸菌的基本形态

2.1.1 乳酸菌的分离纯化与鉴定

根据革兰氏染色、过氧化氢酶试验，共得到乳酸菌80株，再依据菌株在MRS固体上的基本形态及颜色共挑选出28株菌进行测序鉴定。经过富集培养得到一定量的菌株并提其DNA，以其模板进行16S rDNA扩增，经电泳检测，结果见图1。

由图1可知，条带清晰明亮，片段大小约1500 bp，符合测序要求。进而将PCR产物测序结果与Ezbiocloud进行同源性比对，并构建系统发育树，见图2。

图1 部分乳酸菌16S rDNA的PCR扩增产物条带Fig.1 Amplified products of 16S rDNA sequences of several lactic acid bacteria strain

图2 基于16S rDNA的乳酸菌系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of the lactobacillus strains according to 16S rDNA sequences

结合图2可知，处于同一分支上的测序菌株与比对菌株的置信度极高，因此，可以得到测序的23株菌中，乳酸菌有4个属7个种，分别为戊糖乳杆菌13株、副干酪乳杆菌3株、戊糖片球菌2株、类食品乳杆菌2株、干酪乳杆菌1株、食窦魏斯氏菌1株及嗜柠檬酸明串珠菌1株。数量上，戊糖乳杆菌最多，其次是副干酪乳杆菌。根据文献的报道，酸面团中乳酸菌主要是以植物乳杆菌、旧金山乳杆菌及短乳杆菌为优势菌种[18-19]。然而关于新疆馕面团的研究论文中仅有朱晓莹等[20]研究了馕中的乳酸菌，从其分离的菌株来看，并未发现上述3种菌中的任一种。而本次试验结果也未出现，可以断定新疆馕中的优势乳酸菌与其他地方的存在差异。

不同地区样品中乳酸菌的分布情况见表2。

表2 不同地区样品中乳酸菌的分布情况Table 2 Distribution of lactobacillus from different samples in different regions

由表2可知，菌种分布最多的是库尔勒及阿拉尔，戊糖乳杆菌广泛存在于7个地区，嗜柠檬酸明串珠菌只存在于阿拉尔地区，是该地区的特有菌株。

2.1.2 非乳酸菌的分离纯化及鉴定

在乳酸菌的筛选过程中获得了17株非乳酸菌细菌，根据菌株的颜色、形态和状态进一步区分挑选出不相同的菌株5株，并提取其DNA，经过PCR扩增、电泳后测序，将其结果构建系统发育树，见图3。

图3 非乳酸菌16S rDNA序列的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of the non-lactobacillus strains according to 16S rDNA sequences

在17株非乳酸菌中，马洛姆西杆菌仅伊犁的样品未发现，暹罗芽孢杆菌发现于库尔勒和昌吉地区，表皮葡萄球菌在库尔勒、阿克苏及阿拉尔样品中都存在。具体数量见表3。

表3 非乳酸菌在各地区的分布Table 3 Distribution of non-lactobacillus stains in various regions

由图3可知，5株非乳酸菌包含3种菌，分别为（醋酸菌属）马洛姆西杆菌3株、表皮葡萄球菌1株、暹罗芽孢杆菌1株。马洛姆西杆菌属于醋酸菌的一种，能代谢产生乙醇、二氧化碳及醋酸等物质，代谢物能增加面食的风味同时改善面团的质构，而醋酸可以降低面团的pH值从而抑制腐败微生物的生长繁殖。暹罗芽孢杆菌尚未了解其特性。表皮葡萄球菌多数为非致病菌，少数致病。这表明了传统酸面团中可能存在一些有害细菌。

2.2 酵母菌的基本形态

2.2.1 利用WL营养琼脂培养基对酵母菌的基本分类

通过在WL琼脂上菌株菌落的形态颜色观察，结合文献报道[21-23]比对分析，结果见表4、图4。不同酵母菌在各地区的分布见图5。

表4 酵母菌在WL营养琼脂培养基上的形态描述Table 4 Description of morphology of the yeasts on WL media

由表 4、图 4 可知，其中类型 5、6、7、9、16、17、18、19可能为酿酒酵母，类型2、12可能为毕赤酵母，类型15可能为红酵母，其他类型则未提及。将12份样品经过筛选纯化后，共得到229株菌，利用酵母菌在WL培养基上呈现不同颜色进行分类，从而得到19种类型。由图5可知，其中类型5、7、17、18广泛分布于7个地区，类型15只存在于库尔勒地区，库尔勒地区酵母菌菌落形态分布最多，有15种，喀什地区菌落形态最少分布最少，只有6种。

图4 不同菌株在WL营养琼脂培养基上的形态Fig.4 The morphology of the different strains on WL nutrient agar media

图5 不同类型酵母菌在各地区的分布Fig.5 Distribution of different morphology of the yeasts in various regions

2.2.2 酵母菌26S rDNA D1/D2区分析

根据菌落的形状、颜色、状态选取不同的代表菌株33株提取其DNA，并进行26S rDNA的D1/D2PCR扩增，经电泳，条带大约在600 bp，见图6，符合测序要求，检测后，将结果与NCBI进行同源性比对分析并构建系统发育树，见图7。

图6 部分酵母菌26S rDNA D1/D2 PCR产物Fig.6 Amplified products of the D1/D2 sequences of several yeast strains

图7 酵母菌基于26S rDNA的系统发育树Fig.7 Phylogenetic tree of the yeast strains according to 26S rDNA

根据测序结果得出： 类型 5、6、7、8、9、16、17、18、19鉴定为酿酒酵母；类型1鉴定为假丝酵母；类型2鉴定为异常威克汉姆酵母；类型3、4鉴定为近平滑假丝酵母菌；类型10鉴定扣囊复膜酵母；类型11鉴定为克鲁维毕赤酵母；类型12鉴定为库德里阿兹威毕赤酵母；类型13、14鉴定为奥默柯达菌；类型15鉴定为胶红酵母。鉴定的33株菌中，酿酒酵母18株，假丝酵母1株，异常威克汉姆酵母1株，近平滑假丝酵母菌7株及胶红酵母6株；乳酸菌80株，共鉴定近平滑假丝酵母菌2株，扣囊复膜酵母2株，克鲁维毕赤酵母1株，库德里阿兹威毕赤酵母3株，奥默柯达菌4株，胶红酵母1株，共7个属9个种。

2.2.3 各地区酵母菌分布情况

酵母菌在各地区总的分布见表5。

表5 酵母菌在各地区总的分布Table 5 Distribution of the yeasts in various regions

从表5可以看出，酿酒酵母是分布最广，数量最多的菌种，并且在所有地区均有发现，这与以往的研究一致。异常威克汉姆酵母也分布较广，研究发现，其能产生抑菌物质从而延长面食的货架期[24]，这与新疆馕有超长的食用周期可能存在一定的关系。胶红酵母仅存在于库尔勒地区，说明是该地区的特有菌株。

3 结论

通过对新疆7个地区12个样品的研究发现，不同地区的酸面团菌种区别较大。主要对其中的酵母和乳酸菌进行检测，结论如下：乳酸菌发现7种，分别为戊糖乳杆菌、副干酪乳杆菌、戊糖片球菌、类食品乳杆菌、干酪乳杆菌、食窦魏斯氏菌及嗜柠檬酸明串珠菌，从菌种占的数量和地区分布来看，戊糖乳杆菌和类食品乳杆菌为优势菌；酵母菌发现9种，分别为假丝酵母、异常威克汉姆酵母、近平滑假丝酵母、酿酒酵母、扣囊复膜酵母、克鲁维毕赤酵母、库德里阿兹威毕赤酵母、奥默柯达菌及胶红酵母，酿酒酵母为优势菌；非乳酸菌3株，分别为马洛姆西杆菌、表皮葡萄球菌及暹罗芽孢杆菌。由此可知，传统酸面团菌种组成复杂多样，正是其复杂的微生物菌相致使传统发酵面食拥有独特的风味和口感。本次研究也说明了新疆不同地区不同酸面团样品的微生物存在明显差异，这为以后的深入研究奠定基础。