化瘀通络灸对血管性痴呆大鼠髓鞘再生相关蛋白表达的影响

王维顺，杨 骏，樊吟秋，王 萍，查必祥，孔 钰，张雅婷

(1.安徽中医药大学研究生院，安徽 合肥 230012；2.安徽中医药大学第一附属医院，安徽 合肥 230031)

血管性痴呆(vascular dementia，VD)是指由缺血性、出血性卒中等血管性脑损伤疾病所产生的认知障碍综合征，其临床表现以记忆、行为和认知功能缺损为主[1]。VD是仅次于阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)的常见痴呆类型[2]，约占所有痴呆病例的15%～20%[3]。VD目前尚无有效的治疗手段，而艾灸可改善VD认知障碍，促进脑内神经新生和VD后神经干细胞(neural stem cells，NSCs)的增殖、迁移、分化[4]。研究[5]表明，VD的病理特征除灰质损伤外，还包括白质损伤和髓鞘缺失。但既往研究主要着眼于脑灰质及构成灰质主体的神经细胞，针灸对VD后脑白质功能的影响鲜有报道。实际上除了大脑灰质会发生缺血、低氧损伤外，大脑白质亦对缺血、低氧敏感，因此脑白质的脱髓鞘病变被认为是VD的发病机制之一[6]。

化瘀通络灸是治疗脑血管病的有效方法，前期的临床研究和基础实验[7-8]均证实了化瘀通络灸治疗VD的疗效。本实验观察化瘀通络灸对VD大鼠髓鞘再生相关蛋白表达的影响，探讨化瘀通络灸治疗VD的可能作用机制。

1 材料

1.1 动物 选用SPF级健康成年雄性Wistar大鼠60只，由济南朋悦实验动物繁育有限公司[生产许可证号：SCXK(鲁)2019-0003]提供，体质量(250±20)g。统一饲养于安徽中医药大学针灸经络研究所普通级动物房。饲养条件：恒温(25±1)℃，湿度(50±10)%。实验获得安徽中医药大学实验动物伦理委员会批准，伦理审批号：AHUCM-rats-2022034。

1.2 试剂 氯马斯汀(批号 C129211)：阿拉丁；髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein，MBP)一抗(批号 bs-0258R)、髓鞘相关糖蛋白(myelin associated glycoprotein，MAG)一抗(批号 bs-0380R)：北京Bioss公司；Alexa Fluor 488标记山羊抗兔IgG(H+L)(批号 A0423)：上海碧云天生物技术有限公司；羊抗兔HRP标记二抗(批号 L3012)：美国SAB公司。

1.3 仪器 Morris水迷宫：北京众实迪创科技发展有限公司；RM2016病理切片机：德国Leica；全自动数字扫描仪：匈牙利3DHISTECH公司；垂直电泳仪：美国Bio-Rad公司。

2 方法

2.1 模型复制与分组 将大鼠饲养1周后，使用Morris水迷宫实验筛除原地旋转、漂浮不动和特别灵敏的大鼠，将余下55只纳入实验。采用随机数字表法将12只大鼠随机选为假手术组，其余大鼠用于复制VD模型。采用双侧颈总动脉永久结扎法复制VD大鼠模型[9]。术前大鼠禁水、禁食8 h，3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔注射麻醉，浅反射消失后，将大鼠固定在特制鼠板上，无菌操作，在大鼠颈部正中作纵向切口，用镊子钝性分离一侧颈总动脉，避免触碰神经，动脉夹夹闭右侧颈总动脉10 min，松开10 min，夹闭、松开反复操作3次，用4-0号外科缝线分别在动脉近心端及远心端永久结扎，从中间剪断动脉，缝合伤口，分开放回笼中饲养。1周后再以相同方法处理左侧颈总动脉。假手术组按上述操作，分离颈总动脉后不作其他处理。模型复制3 d后，用水迷宫对大鼠进行模型鉴定。将假手术组大鼠定位航行实验第4天逃避潜伏期的平均值作为参考值，再将模型复制后的每只大鼠第4天的平均逃避潜伏期减去参考值，所得差值与该鼠的平均逃避潜伏期相除得一比值，若比值超过20%，则表明模型复制成功[10]。筛选模型成功的VD大鼠36只，随机分为艾灸组、西药组、模型组，每组12只。

2.2 各组干预方法 艾灸组大鼠参照《实验动物常用穴位名称与定位》[11]选取“大椎”“百会”“神庭”穴进行艾灸，将大鼠固定于自制的灸架上，点燃清艾条(5 mm×12 cm，江苏康美制药有限公司)，于相应穴位上1～2 cm处进行悬灸，每天20 min，7 d为1个疗程，共干预3个疗程。西药组大鼠用氯马斯汀(H1受体拮抗剂)与蒸馏水配置灌胃溶液，按10 mL/kg灌胃，每日2次，7 d为1个疗程，共干预3个疗程。仅将假手术组和模型组大鼠放于灸架上，不作其他任何处理，干预时间同艾灸组。

2.3 观察指标及方法

2.3.1 定位航行实验 Morris水迷宫为大鼠通用型泳池，避光，控制水温为(23±2)℃。沿水池周长等距分布，水池区域被划分为4个象限，透明圆形平台放在第3象限中间位置水下2 cm。将大鼠分别从4个象限放入水中，其逃避潜伏期为2 min内找到平台的时间。2 min内仍未找到平台的大鼠，将此次入水逃避潜伏期记录为2 min，然后将大鼠引导到平台上，停留30 s。连续训练4 d，确保大鼠每天实验时间相同，每次入水时位置相同。

2.3.2 免疫荧光染色法检测大鼠胼胝体区MAG、MBP阳性细胞表达水平 治疗结束24 h内，每组各取6只大鼠灌注4%多聚甲醛后取脑，将大脑组织用石蜡包埋后切片。切片使用0.01 mmol/L PBS漂洗，羊血清封闭，加入一抗MAG、MBP(1∶200)，4 ℃过夜，二抗使用Alexa Fluor 488标记山羊抗兔IgG(H+L)(1∶500)，DAPI复染细胞核。阴性对照采用PBS代替一抗，其余步骤不变。用全自动数字扫描仪扫描整个脑片区域，重点观察胼胝体区MAG、MBP的表达水平。

2.3.3 Western blot法检测大鼠胼胝体区MAG、MBP表达水平 取剩余6只大鼠断头后取脑，冰上提取胼胝体，-80 ℃保存。裂解液提取组织总蛋白后，经上样、电泳、转膜等过程，分别加入一抗MBP(1∶1 000)、MAG(1∶1 000)，4 ℃孵育摇床过夜。加入羊抗兔HRP标记二抗(1∶5 000)，再使用ECL化学发光液显影，放入成像系统中扫描，使用Image J软件读取灰度值。

3 结果

3.1 各组大鼠Morris水迷宫逃避潜伏期比较 模型复制3 d后，用水迷宫对大鼠进行模型鉴定，假手术组大鼠(n=12)逃避潜伏期为(11.06±3.23)s，VD模型大鼠(n=36)逃避潜伏期为(66.58±31.76)s，两组大鼠逃避潜伏期比较，差异有统计学意义(P<0.05)，说明VD大鼠模型制备成功。

与假手术组比较，干预后模型组逃避潜伏期延长(P<0.05)；与模型组比较，艾灸组、西药组逃避潜伏期均显著缩短(P<0.05)。见图1。

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

3.2 各组大鼠胼胝体区MAG、MBP阳性细胞表达水平比较 胼胝体区MAG、MBP染色为丝状。与假手术组比较，模型组胼胝体区MAG、MBP平均荧光强度均降低(P<0.05)；与模型组比较，艾灸组MAG、MBP平均荧光强度增强(P<0.05)；与西药组比较，艾灸组MAG平均荧光强度增强(P<0.05)，MBP平均荧光强度差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

注：A.假手术组；B.模型组；C.艾灸组；D.西药组；与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与西药组比较，△P<0.05

3.3 各组大鼠胼胝体区MAG、MBP表达水平比较 与假手术组比较，模型组胼胝体区MAG、MBP表达水平下降(P<0.05)；与模型组比较，艾灸组MAG、MBP表达水平增加(P<0.05)；与西药组比较，艾灸组MAG表达水平增加(P<0.05)，MBP表达水平组间差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。

注：A.假手术组；B.模型组；C.艾灸组；D.西药组；与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与西药组比较，△P<0.05

4 讨论

VD属于中医学“呆病”范畴，年老肾精不足，气血亏虚，血脉瘀滞，脑络瘀阻，日久可导致脑失所养、髓脑空虚，发为本病，故血瘀与VD密切相关。化瘀通络灸取督脉百会、大椎、神庭穴，发挥艾灸温阳通脉、活血散结的作用，以充养脑髓、安神宁志。研究[12]表明，针刺“百会”等督脉穴不仅可以改善学习记忆能力，而且能促进脑缺血大鼠脑白质髓鞘再生。本实验通过Morris水迷宫观察发现，艾灸干预后VD大鼠的逃避潜伏期比治疗前显著减少，说明化瘀通络灸能改善VD大鼠学习记忆能力。这与课题组前期报道[13]的化瘀通络灸能够明显改善VD大鼠学习记忆能力的研究结果一致。

脑白质由许多髓鞘化的轴突组成，其基础代谢率高，因此即使是轻微缺血也会造成脑白质损伤。胼胝体是大脑最大的白质带，是VD的主要损伤部位，故选用胼胝体作为VD白质损伤的观察对象。髓鞘是白质中必不可少的成分，由成熟少突胶质细胞发出的细胞突起包裹神经细胞轴突形成。髓鞘的完整性对脑白质功能的恢复至关重要，因此髓鞘脱失也会引起以认知障碍为主的一系列临床综合征[14]。当提供营养支持时，脑白质中的髓鞘被激活，发生增殖，并迁移到损伤部位，使髓鞘重新包裹轴突，这个过程称为“髓鞘再生”[15]。同时实验研究[16]证明，氯马斯汀(H1受体拮抗剂)具有增强少突胶质细胞分化和促进髓鞘再生的作用，因此本研究选择氯马斯汀作为阳性对照药。

MAG是构成髓鞘的重要成分之一，其表达在髓鞘的最内层，直接与轴突表面相邻，具有稳定轴-髓鞘方面的作用、维持髓鞘结构的完整性等[17]。有研究[18]报道，脱髓鞘会导致MAG损失，MAG可能是髓鞘形成所必需的物质。MBP位于髓鞘浆液表面，是髓鞘的特异性标志物，可启动髓鞘的合成，稳定髓鞘的结构[19]。同时既往实验[20]表明，大脑缺血损伤后，髓鞘相关蛋白MAG、MBP含量明显降低。因此，髓鞘相关蛋白MAG、MBP表达水平的高低可反映髓鞘再生情况和中枢神经系统功能恢复程度。

本研究结果表明，与假手术组比较，模型组大鼠髓鞘相关蛋白MAG、MBP表达水平均显著降低(P<0.05)；与模型组比较，艾灸组髓鞘相关蛋白MAG、MBP表达水平均显著升高(P<0.05)。结果提示化瘀通络灸能够促进髓鞘相关蛋白MAG、MBP的合成，促进髓鞘再生。与西药组比较，艾灸组MAG表达水平升高(P<0.05)，说明艾灸组的疗效优于西药组；艾灸组MBP表达趋势略优于西药组，但差异无统计学意义(P>0.05)，究其原因可能与样本量不足有关。由此推断，艾灸能够加快大鼠脑白质髓鞘损伤的修复，从而证实化瘀通络灸可以促进髓鞘再生，对促进髓鞘再生起到积极作用。

综上，化瘀通络灸能促进VD大鼠髓鞘相关蛋白MAG、MBP的合成，促使髓鞘再生，从而改善VD大鼠的学习记忆能力。