新疆地区绝经后T2DM患者LRP6基因位点多态性及突变与骨密度的相关性*

王娅宁，李 军，李思源，邵 晗，王 双，石艳秋，李佳佳

(1.新疆石河子大学医学院，新疆 石河子 832000；2.石河子大学医学院第一附属医院内分泌代谢科，新疆 石河子 832000；3.上海市杨浦区中心医院，上海 200082；4.浙江萧山医院，浙江 杭州 310000；5.南阳市第二人民医院，河南 南阳 473000)

糖尿病是一种遗传和环境共同作用导致血糖升高的慢性代谢性疾病，其中2型糖尿病(T2DM)的发病是由多种基因共同参与的[1]。骨质疏松症(OP)是一种以骨组织微结构受损、骨密度(BMD)下降为特征的代谢性疾病，常见于绝经后女性，OP是T2DM的常见并发症[2]。Wnt信号通路是调节细胞生长、增殖的关键，与糖、脂、骨代谢密切相关[3]。低密度脂蛋白受体相关蛋白6(LRP6)基因可通过激活Wnt通路[4]，参与T2DM[5]、OP[6]的发生和发展。ZENIBAYASHI等[7]在日本人群开展的一项研究发现，LRP6基因rs2417086、rs10743980位点突变与T2DM有关。目前，我国新疆地区T2DM患病率较高，而这些患者常合并OP，本研究对LRP6基因的研究不是第一个，但以往对LRP6基因多态性及突变的研究存在冲突，关于绝经后T2DM患者LRP6基因与BMD关系的研究较少见，并且国内很少有学者对LRP6基因在绝经后T2DM合并OP患者进行研究。因此，本研究测定了我国新疆地区绝经后T2DM患者LRP6基因rs10743980、rs2302685位点多态性及突变情况，探讨了我国新疆地区绝经后T2DM患者这类特殊人群中LRP6基因位点多态性及突变与BMD的关系，旨在预防T2DM合并OP的发生。

1 资料与方法

1.1资料

1.1.1研究对象 选取2018年11月至2019年10月石河子大学医学院第一附属医院门诊、住院及社区收治的绝经后女性136例，根据不同血糖及BMD分为糖耐量正常伴骨量正常组(A组，26例)、T2DM伴骨量正常组(B组，27例)、糖耐量正常伴骨量异常组(C组，28例)和T2DM伴骨量异常组(D组，55例)。本研究获石河子大学医学院第一附属医院伦理委员会审批。

1.1.2纳入标准 (1)自然绝经后女性，年龄50～80岁；(2)符合T2DM和OP 1999年世界卫生组织推荐的诊断标准[8-9]；(3)签署本研究知情同意书。

1.1.3排除标准 (1)1型糖尿病；(2)自身免疫性疾病；(3)严重心、肝、肾脏疾病；(4)恶性肿瘤；(5)对钙(Ca)及其他骨代谢指标有影响的基础疾病。

1.2方法

1.2.1资料收集 包括患者年龄、绝经年限、体重指数(BMI)和腰臀比(WHR)等一般资料。

1.2.2实验室检测 采用高压液相法测定糖化血红蛋白(HbA1c)，罗氏全自动生化分析仪(型号 Modular DPP-H7600)测定空腹血糖(FPG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、甘油三酯(TG)、Ca、磷(P)和碱性磷酸酶(ALP)。采用双能X线吸收法测定腰椎(L)1～4、股骨颈BMD。采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱方法测定LRP6基因rs10743980、rs2302685位点基因多态性及基因型分布频率。

1.2.3Hardy-Weinberg 遗传平衡检测 在A组中进行遗传平衡检验。LRP6 基因rs10743980、rs2302685位点的基因型分布频率与Hardy-Weinberg平衡相符，差异无统计学意义(P>0.05)。

2 结 果

2.1各组患者一般资料比较 与A组比较，D组患者年龄、绝经年限均更高，差异均有统计学意义(P<0.05)。B组患者年龄、绝经年限、WHR均高于A组，BMI低于A组；C组患者年龄、绝经年限高于A组，WHR、BMI低于A组，但差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组患者一般资料比较[M(P25,P75)]

2.2各组患者实验室检测指标比较 与A组比较，B、D组患者FPG、HbA1c均更高，C、D组患者TG，以及L1～4、股骨颈BMD均更低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组患者实验室检测指标比较[M(P25,P75)或

2.3各组患者LRP6基因rs10743980、rs2302685位点基因型与等位基因分布频率比较 各组患者LRP6基因rs10743980、rs2302685位点基因型和基因频率比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3。因LRP6 基因rs10743980位点TT基因型和rs2302685位点CC基因型患者数较少，故将CT与TT合并，CT与CC合并，纳入突变型组。

表3 各组患者LRP6基因rs10743980、rs2302685位点基因型与等位基因分布频率比较[n(%)]

2.4各组患者中LRP6基因rs10743980位点野生型(CC基因型)与突变型(CT/TT基因型)者实验室检测指标比较 A、B、C组患者中LRP6基因rs10743980位点CC基因型与CT/TT基因型者实验室检测指标比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。D组患者中CC基因型者HbA1c明显低于CT/TT基因型，TG、股骨颈BMD均明显高于CT/TT基因型，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 D组患者中LRP6基因rs10743980位点CC基因型与CT/TT基因型者实验室检测指标比较

2.5各组患者中LRP6基因rs2302685位点野生型(TT基因型)与突变型(TC/CC基因型)者实验室检测指标比较 A、B、C组患者中LRP6基因rs2302685位点TT基因型与TC/CC基因型者实验室检测指标比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。D组患者中TT基因型者HDL-C明显低于TC/CC基因型者，TG、Ca、L1～4BMD均明显高于TC/CC 基因型，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表5。

表5 D组患者中LRP6基因rs2302685位点TT基因型与TC/CC基因型者实验室检测指标比较

2.6LRP6基因rs10743980、rs2302685位点野生型和突变型患者BMD比较 与CC×TT患者比较，CT/TT×TT患者L1～4BMD更低[分别为(1.01±0.12)、(0.93±0.11)g/m2]，CC×CT/CC患者股骨颈BMD更低[分别为(0.79±0.13)、(0.73±0.09)g/m2]，CT/TT×CT/CC患者L1～4、股骨颈BMD降低更明显[分别为(1.01±0.12)、(0.83±0.14)g/m2，(0.79±0.13)、(0.71±0.15)g/m2]。说明在同一基因中当存在两位点同时突变时会造成更低的BMD。见图1。

注：A. L1～4 BMD ；B. 股骨颈BMD。CC×TT为rs10743980位点CC基因型合并rs2302685位点TT基因型；CT/TT×TT为rs10743980位点CT/TT基因型合并rs2302685位点TT基因型；CC×CT/CC为rs10743980位点CC基因型合并rs2302685位点CT/CC基因型；CT/TT×CT/CC为rs10743980位点CT/TT基因型合并rs2302685位点CT/CC基因型。

2.7多元线性回归模型分析 HDL-C升高、BMI降低是股骨颈BMD降低的危险因素(P<0.05)；LRP6基因 rs10743980位点突变是L1～4BMD降低的危险因素(P<0.05)。见表6。

表6 多元线性回归模型分析

3 讨 论

OP是中老年人常见病，而T2DM患者更易合并OP，OP常表现为BMD降低，OP患者骨折风险大大增加，为人们生活带来了沉重的经济负担[10]。OP受多种因素，如年龄、绝经年限、激素水平等影响。有研究表明，随年龄增长，成年女性骨皮质孔隙分别增加176%和259%[11]。年龄增长与骨细胞数量减少密切相关[12-13]。另外，随年龄增加而出现的骨细胞死亡增多与多种因素相关，包括雌激素缺乏、脂质过氧化、内源性糖皮质激素过量等。雌激素缺乏人群骨细胞凋亡增加，进而导致骨量减少[14-16]，证明了雌激素缺乏对骨重塑平衡具有不良影响。由于女性围绝经期卵巢功能衰退，年龄增长与雌激素缺乏时期重叠，两因素间可能存在协同作用[17]。马峥[18]研究表明，绝经后女性OP患病率为53.3%，明显高于全国平均水平(23.7%)。多项研究均证实，雌激素对BMD具有保护作用。ABDI等[19]研究结果显示，对绝经后女性经皮雌激素给药治疗后，1年和2年后腰椎BMD分别比基线值增高3.4%和3.7%。本研究结果显示，随年龄及绝经年限的增长，OP患病率也增加。

LRP6是组成Wnt信号通路的跨膜受体蛋白，其基因突变会导致Wnt信号通路失去对细胞的调控作用。同时，Wnt信号通路与T2DM[20]、OP[21]、血脂代谢[22]等多种疾病相关，但目前LRP6基因在我国新疆地区绝经后T2DM合并OP患者中尚鲜见报道。 RIANCHO等[23]在绝经后女性中的研究结果显示，LRP6基因rs2302685、rs11054704位点多态性与BMD相关。同样，本研究也对我国新疆地区绝经后T2DM患者LRP6基因rs10743980、rs2302685位点进行了研究，结果显示，基因多态性和基因频率均与BMD无关。本研究结果与上述研究不相同的原因可能是，上述研究结果大多数来自欧洲及北美人群，不同基因在不同人群中表达不一致，样本量的大小及纳入人群的标准也不完全相同。

在基因突变与BMD研究方面，LI等[24]在对Wnt信号通路的研究中也证实绝经后女性BMD水平降低与LRP6基因突变有关。STÜRZNICKEL等[25]同样证实在骨代谢和骨折中LRP5、LRP6基因共同发挥作用。本研究结果显示，A、B、C组患者中LRP6基因rs10743980、rs2302685位点野生型与突变型者各实验室检测指标比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，造成这种结果可能的原因是OP的发病机制相对复杂，而D组患者年龄、绝经年限均高于A、B、C组，疾病的发生多是由基因-环境相互作用引起的，在LRP6基因单核苷酸多态性位点突变的前提下，多个环境因素相互叠加更易导致代谢异常。而D组患者中LRP6基因 rs10743980位点股骨颈BMD野生型高于突变型且该位点突变是L1～4BMD降低的危险因素，LRP6基因rs2302685位点Ca、L1～4BMD野生型高于突变型，提示LRP6基因两位点突变均参与了BMD的降低。故本研究又针对基因突变对纳入的我国新疆地区绝经女性进行了人群分类，结果显示，基因突变人群BMD低于未发生基因突变者，当两基因同时突变时BMD降低更明显。表明上述位点突变型患者BMD低于野生型，其中可能是由于LRP6位点突变影响了成骨细胞的分化，导致Wnt3a信号传导关键介质LRP6的缺失，从而引起骨代谢异常[26]。

BMI降低是股骨颈BMD降低的危险因素，BMI在一定范围内增加时患者骨骼抗机械应力的能力增强，刺激成骨细胞的分裂[27]；HDL-C升高是股骨颈BMD降低的危险因素。有研究发现，LRP6蛋白有助于清除体内LDL-C，而LRP6基因突变导致LDL-C清除障碍、HDL-C功能受损。但维生素D缺乏的绝经后女性血清HDL水平与BMD呈负相关[28]。因此，LRP6可能成为BMD的潜在调节因子。

既往研究发现，LRP6基因突变型者TG、LDL-C均高于野生型[29]，从而使LRP6基因突变体携带者患T2DM的风险增高。本研究结果显示，D组患者LRP6基因rs10743980位点中HbA1c水平突变型均高于野生型，TG水平突变型低于野生型，LRP6基因rs2302685位点中HDL-C水平突变型高于野生型，TG水平突变型低于野生型，提示LRP6基因突变参与了糖、脂代谢紊乱，与上述研究结果不一致。原因可能是，LRP6是Wnt信号通路协同受体之一，在糖、脂代谢调节过程中常需要多个协同受体(LRP5、LRP6、硬化蛋白等)共同作用调节下游分子的表达，调控生理机制，从而影响物质代谢[30]。因此，应在不同人群、不同地区进行进一步研究，单一基因突变可能被其他因素覆盖。

本研究局限性：样本量相对较小，应在较大样本量中证实这种关系；应包括更多的LRP6基因单核苷酸多态性位点；影响BMD下降的机制错综复杂，在今后的研究中应关注基因-环境相互作用对BMD的影响。

综上所述，我国新疆地区绝经后女性LRP6基因rs10743980、rs2302685位点多态性与BMD可能无关，但绝经后T2DM合并OP患者rs10743980、rs2302685位点突变参与了BMD的降低，从而在基因水平上为绝经后女性患T2DM合并OP的发生提供了理论依据。因此，对绝经后T2DM患者应注意筛查，提早干预，预防OP的发生。