香蕉皮抗氧化和抑制人肝癌HepG2细胞活性研究

王士博 ， 刘金娟

江苏师范大学生命科学学院，江苏 徐州 221116

香蕉（Musa sapientum）是热带地区重要的经济作物，内部果肉为主要的食用部位。2020年，世界香蕉总产量为119.83×109kg，我国香蕉总产量为11.87×109kg，并且呈逐年上升趋势，我国已成为世界第二大香蕉生产国［1］。香蕉皮大约占果实重量的30%左右，大量香蕉皮的废弃不仅造成资源浪费，还会引起环境污染。研究表明，香蕉皮中含有丰富的淀粉、粗蛋白、粗脂肪和糖类、维生素、多酚类等物质［2］，具有抗高血压、抗癌、抗菌、抗氧化等活性［3-4］。香蕉皮中总黄酮对羟自由基、ABTS+自由基均有一定的清除能力及Fe3+还原能力［5］。Rebello等［6］发现香蕉皮粉因其总酚含量高而具有高抗氧化性。Akamine等［7］发现香蕉皮甲醇提取物对睾酮治疗小鼠前列腺增生有抑制作用。Fu等［8］从香蕉皮提取物中分离得到的新化合物XJP-1能抑制ox-LDL诱导的单核细胞内皮粘附。熊燕飞等［9］发现香蕉皮粗多糖可明显抑制体内实体瘤生长，体外对Hela细胞和前列腺癌PC-3M细胞有明显的诱导凋亡作用，且随时间的延长，凋亡率增加。目前，国内对于香蕉皮的研究主要集中于多糖、多酚等物质的提取方法和工艺，对其功能及深加工方面的研究相对不足。关于香蕉皮提取物在抗癌和抗氧化活性方面的研究少有系统报道。充分发挥香蕉皮的资源优势，对其进行高值化开发利用，不仅可以减少对环境的污染，同时也能产生极大的经济价值和社会效益。因此，本文初步测定了香蕉皮提取物（banana peel extraction，BPE）中总黄酮和总多酚的含量，探究了BPE对DPPH和O2-自由基的清除能力以及对HepG2细胞增殖的抑制作用，以期为进一步综合利用香蕉皮提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 实验材料和试剂

香蕉购自本地大型超市，正常成熟度，表面洗净晾干水分，取皮后用家用榨汁机取汁，12 000 r·min-1，4 ℃离心取上清，过滤除菌后-80 ℃储存备用。

Alamar Blue购自美国Sigma公司；Caspase-9、Caspase-3抗体购自美国Santa cruz公司；Bad、Bid、Bak、Apaf-1、Bax、Bcl-X、Bcl-2、p53和GAPDH抗体购自美国Bioworld公司；细胞裂解液、Caspase-9和Caspase-3活性检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所；PARP抗体和Caspase-3抑制剂Ac-DEVDCHO购自碧云天生物技术研究所；Caspase-9抑制剂Z-LEHD-FMK购自Biovision公司；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 供试细胞株

人肝癌细胞HepG2购于上海中科院细胞库，由本实验室复苏、传代、培养。

1.3 仪器与设备

IBE2000显微镜购自COIC公司；CO2细胞培养箱购自Thermo公司；微孔板检测仪购自Bio-Teck公司；96孔细胞培养板购自美国NEST公司；荧光显微镜购自德国Leica公司。

1.4 方法

1.4.1总多酚和总黄酮含量的测定 采用福林酚法和硝酸铝比色法分别检测总酚和黄酮含量［10］。提取物中总酚和总黄酮的含量以每升BEP中没食子酸和芦丁当量表示。制作没食子酸（0～200 μg·mL-1）标准曲线，按公式（1）计算BPE中总酚的含量：

其中y为吸收值；x为没食子酸浓度。

制作芦丁（0～64 μg·mL-1）标准曲线，按公式（2）计算BPE中总黄酮的含量：

其中y为吸收值；x为芦丁的浓度。

1.4.2DPPH自由基清除测定 参照钟丘实等［11］测定方法，本研究使用的BPE为原液。

1.4.3超氧阴离子自由基清除测定 采用邻苯三酚自氧化法，参照佀凤为等［12］的方法，使用BPE原液进行测定。

1.4.4细胞培养与体外抗肿瘤活性实验 采用Alamar Blue法检测BPE体外抗肿瘤活性，具体实验方法参照Liu等［13］的方法。

1.4.5Hoechst 33258染色 取形态均匀状态良好的HepG2细胞接种于6孔培养板中，加入BPE培养48 h后，用倒置相差显微镜观察形态并拍照；细胞收集后，加入Hoechst33258染液（终浓度5 μg·mL-1），染色10 min，荧光显微镜下拍照，实验重复3次。

1.4.6流式细胞术检测细胞凋亡 实验步骤参照Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒说明书。

1.4.7活性氧检测 按照试剂盒的说明书进行操作，10 μmol·L-1DCFH-DA染液37℃孵育20 min。激发波长488 nm，发射波长525 nm，荧光显微镜观察。

1.4.8Western blot实验 BPE处理HepG2细胞48 h后提取蛋白，SDS-PAGE电泳分离，转移到PVDF膜上，封闭后加入一抗过夜，二抗37 ℃孵育2 h，化学发光显色拍照。

1.4.9Caspase酶活性的检测 按照酶活性检测试剂盒说明书进行Caspase酶活性测定。

1.4.10抑制剂对BPE抗肿瘤活性的影响 HepG2细胞接种96孔板，贴壁后加入10 μmol·L-1Z-LEHD-FMK或20 μmol·L-1Ac-DEVD-CHO，孵育2 h后加入BPE继续培养48 h，检测细胞活性。

1.4.11数据分析 每个实验均重复3次，结果以均值±标准偏差表示，采用SPSS 18.0统计软件进行单因子方差分析，P＜0.05表示统计学上有差异。

2 结果与分析

2.1 BPE中总黄酮和总多酚含量

使用福林酚法检测BPE中总酚含量，结果为39.23±2.35 mg·L-1；采用硝酸铝比色法检测总黄酮量，结果为26.53±1.97 mg·L-1。

2.2 BPE自由基清除能力

通过研究BPE对DPPH·和O2-·的清除率评估其抗氧化活性，结果显示BPE对DPPH和O2-自由基的清除率分别为65.31%±3.82%和51.29%±4.23%。

2.3 BPE对HepG2细胞增殖活性的影响

不同浓度（0～100 mL·L-1）BPE处理HepG2细胞48 h后，Alamar Blue检测结果显示（图1），与对照组相比，随着BPE浓度的增加，HepG2细胞的活性逐渐降低，说明BPE对HepG2细胞增殖活性的抑制具有一定浓度依赖性。当BPE处理浓度为80 mL·L-1和100 mL·L-1时，HepG2细胞的活性分别为24%±4.37%和0.73%±0.06%，经计算得到IC50为54.32±2.51 mL·L-1。IC50作为进一步研究BPE抑制HepG2细胞增殖分子机制的浓度选择。

2.4 BPE对HepG2细胞形态的影响

倒置显微镜下观察显示（图2），与对照组相比，BPE（IC50）处理组HepG2细胞的形态结构不规则，发生皱缩且有少量细胞漂浮。荧光显微镜观察显示，经hoechst33258染色后，对照组细胞呈现均匀的蓝色荧光，BPE处理的细胞显示染色质聚集和明亮的荧光，该结果提示BPE可诱导HepG2细胞发生凋亡。

图 1 BPE对HepG2细胞活力的影响Fig. 1 The effect of BPE on cell viability of HepG2 cells

图2 BPE对HepG2细胞形态的影响 (40×)Fig. 2 Mophology of HepG2 cells treated with BPE (40×)

2.5 BPE对HepG2细胞凋亡的影响

为进一步验证hoechst33258染色的结果，流式细胞术检测结果显示，BPE处理组细胞凋亡率为22.21%±2.36%（P＜0.05，与对照组相比）（图3），说明BPE确实可引起细胞的凋亡而发挥抗肿瘤活性。

图3 流式细胞术检测BPE对HepG2细胞凋亡的影响Fig. 3 Effect of BPE on cell apoptosis of HepG2 by flow cytometry

2.6 BPE对HepG2细胞中ROS水平的影响

研究表明，ROS在体内的大量堆积会引起细胞产生毒性作用，导致细胞膜发生过氧化，增加膜通透性，降低细胞内抗氧化酶活性，损伤蛋白质和DNA等物质，最终诱导细胞加速凋亡［14］。如图4所示，与对照组相比，BPE处理组中绿色荧光信号明显增强，这说明BPE能够明显提高HepG2细胞的ROS水平。

图4 BPE对HepG2细胞中ROS水平的影响Fig. 4 Effect of BPE on the ROS level in HepG2 cells

2.7 BPE对HepG2细胞内凋亡蛋白表达的影响

Western blot结果显示（图5），与对照组相比，BPE处理组中促凋亡蛋白Bax、Bid、Bak、p53的表达水平提高，而抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl的表达水平降低。PARP、Apaf-1、Caspase-3和Caspase-9在处理组中的表达水平也明显升高。有研究表明，Caspase-9的激活、Bax、Bad和Bak的线粒体易位、MMP的去极化与随后细胞色素c的释放密切相关，后者与Apaf-1、ATP和Caspase-9结合，产生凋亡小体激活的Caspase-3，随后PARP裂解，一旦特异性底物PARP被切断，就会诱导细胞凋亡［15］。

图5 BPE处理48 h后对HepG2细胞中凋亡相关因子蛋白表达的影响Fig. 5 The expression of apoptosis-related factors in HepG2 cells treated with BPE for 48 h

2.8 BPE对HepG2细胞内Caspase-3、Caspase-9酶活性的影响

为了进一步证实Caspase被激活，酶活性试剂盒检测结果表明（图6），BPE能够显著增加HepG2细胞中Caspase-3和Caspase-9的活性，进一步验证了Western blot的结果。

图6 BPE对HepG2细胞中Caspase活性的影响Fig. 6 Effect of BPE on Caspase enzyme activity in HepG2 cells

2.9 Caspase抑制剂对BPE促凋亡的影响

本研究利用Caspase-9和Caspase-3抑制剂（ZLEHD-FMK和Ac-DEVD-CHO）来评估Caspase-9和Caspase-3在BPE诱导细胞凋亡中的作用。结果如图7所示，采用Z-LEHD-FMK和Ac-DEVD-CHO预培养在一定程度上可显著逆转mActD对HepG2细胞的促凋亡作用，进一步证实BPE通过线粒体介导的内在凋亡途径诱导了HepG2细胞凋亡。

图7 抑制剂对BPE促HepG2细胞凋亡的影响Fig. 7 Effect of inhibitor on the proliferation of BPE in HepG2 cells

3 讨论

近年来，研究发现多酚和黄酮广泛存在于各种植物果皮中，具有较强的清除自由基和抗氧化活性，有助于延缓衰老、预防癌症及抗炎症等［15］。不同植物果皮中酚类和黄酮类的生物学活性受结构和种类的影响，会显示出不同的抗氧化活性［16-17］。鳄梨果皮中含有大量的多酚和黄酮类等物质，对DPPH自由基具有明显的清除能力［18］。利用超声辅助法提取香蕉皮中的多酚，发现对花生油有较强的抗氧化效果［19］。采用有机溶剂浸提法提取香蕉皮中的总黄酮，在一定范围内对羟基自由基的清除率优于同条件的维生素C［20］。本研究结果与上述文献的结果一致，证明香蕉皮提取物中具有一定量的总多酚和总黄酮，进一步的自由基清除实验证实了BPE的体外抗氧化清除能力，这为香蕉皮抗氧化产品的开发提供了重要的数据支撑。

研究发现，果皮提取物在癌症治疗和预防方面具有明显的作用［21］。例如，柑橘皮中的黄酮在预防癌症发生中发挥功能［22］；石榴皮提取物具有明显的抗氧化活性以及对leukemia细胞的抗肿瘤和诱导凋亡活性［23］；富含多酚的山楂果皮提取物可诱导MCF-7细胞的凋亡［24］。与先前研究报道相一致，本研究在体外抗肝癌实验中，香蕉皮提取物可有效地抑制人肝癌HepG2细胞的增殖活性，并且通过线粒体介导的信号通路诱导细胞凋亡发挥抗肝癌细胞作用。但研究仅在体外探究了香蕉皮提取物作用于HepG2细胞的作用效果，未结合体内实验，因此，后续将对香蕉提取物作用动物的体内实验进行研究，以及在其他类型的肿瘤中探究其抗肿瘤活性。

综上所述，香蕉皮提取物具有一定清除自由基的能力以及通过线粒体介导的信号通路诱导细胞凋亡发挥抗肝癌作用，研究结果可为香蕉皮提取物用于抗氧化产品开发及肝癌预防提供了数据支持。