固相萃取与气相色谱-质谱法联用测定食用植物油和含脂肪食品中氯丙醇酯的方法验证研究

盛蕖 ， 张涵 ， 万悦 ， 占艳 ， 焦玲玲 ， 卫杨帆 ， 王超 ， 程胜

黄石市疾病预防控制中心，湖北 黄石 435000

氯丙醇及其酯化物是国际公认的食品加工过程污染物，最早于1978年在用于生产酱油的酸水解植物蛋白中被发现［1］。后续研究发现，脂肪含量高的食品在热加工过程中酰基甘油与氯离子发生反应生成氯丙醇及其酯化物［2］。此外，氯丙醇作为一种卤代醇，也是树脂、聚合物、农药和药物生产过程中的试剂和原材料［3］。氯丙醇不稳定，在食品中主要以酯的形式存在［4］。氯丙醇的种类很多，包括 2-氯-1，3-丙二醇（2-MCPD）、3-氯-1，2-丙二醇（3-MCPD）、1，3-二氯-2-丙醇（1，3-DCP）和2，3-二氯-2-丙醇（2，3-DCP），其中毒性最强的为3-MCPD。氯丙醇具有遗传毒性、诱变活性以及潜在的致癌性［5-6］，对人体健康构成较大危害。近年来，氯丙醇在热加工过程食物（食用油脂、儿童食品［5，7-9］、饮用水、食品接触材料［10］）中的发现引起了社会对食品安全的广泛关注。因此，根据已获得的毒理学研究数据，联合国粮食与农业组织（Food and Ariculture Organization of the United Nations，FAO）、世界卫生组织（World Health Organization，WHO）-食品添加剂专家委员会（Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives，JECFA）以及欧盟食品学术研究委员会规定，3-MCPD每日可承受的最大摄入量为2 μg·kg-1bw［11］。

到目前为止，3-MCPD酯主要在一些食用油脂和含油量大的食品（如油炸食品、婴幼儿配方食品）中被检测到［12-15］。由于氯丙醇酯普遍存在于人类的日常饮食中，给该领域的风险评估和再调查研究造成了比较大的困难［2］。在生物体内氯丙醇酯通过消化作用转化成氯丙醇的过程还处在推理阶段，并且上述过程的转化率在人体毒理学的研究中还没有相关数据［16］。因此，在对食品中氯丙醇进行风险评估时，我们假设氯丙醇酯在人体内能够100%转化成氯丙醇［17］。

目前，分析检测食品中的氯丙醇酯通常采用气相色谱-质谱法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）［4，18-20］，通过测定氯丙醇酯的水解产物——氯丙醇的含量，间接得到食品中氯丙醇酯的含量。在此之前，需要通过衍生技术来增强目标物质的反应活性，从而提高方法的灵敏度、分辨率和选择性［21］。直接测定氯丙醇酯的方法很难用于常规分析，因为在这个过程中需要购买大量的标准物质并且在样品基质复杂的情况下目标物质很难完全分离［22］。已报道的前处理方法主要有固相微萃取法（solid phase microextraction，SPME）［23-24］、磁性固相萃取法（magnetic solid phase extraction，MSPE）［25］、加压溶剂萃取法（pressurized liquid extraction，PLE）［18］、分散液-液微萃取法（dispersiveliquid-liquid microextraction，DLLME）［26］。尽管上述方法都能用于检测食品中氯丙醇酯的含量，但样品前处理过程需要大量的溶剂和吸附剂，处理过程十分繁琐且方法灵敏度低，难以满足实际检测的需求。

基于上述现状，建立简单、快速、灵敏的分析方法对于食品中氯丙醇酯的研究、调查以及预防工作至关重要。本团队结合食品安全风险监测工作手册和已报道的方法，运用固相支持液-液萃取净化技术、衍生技术与气相色谱-质谱法相结合的分析方法检测食品中氯丙醇酯的含量，一方面与其他机构之间进行了协同验证，另一方面经过了英国食品分析评估计划（Food Analysis Performance Assessment Scheme，FAPAS）的能力验证，并对76批次的3类食品（油及其制品、谷物及其制品、特殊营养用食品）中氯丙醇酯的含量进行了调查，以期为氯丙醇脂的相关研究和检测提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要仪器

7890B-5977A气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）购自美国Agilent公司，B、I、R、V-300旋转蒸发仪购自瑞士BUCHI公司，SOX500脂肪测定仪，BF-2000氮气吹干仪，QL-901涡旋振荡器，SFG-01B电热恒温鼓风干燥箱，SX2-8-10马弗炉，AS-3120超声波清洗器，SHZ-B水浴恒温振荡器，1 mL气密针，2 mL螺口具盖样品瓶。

1.2 主要试剂与材料

3-氯-1，2-丙二醇双棕榈酸酯（3-MCPD棕榈酸二酯，纯度98%），氘代同位素内标3-氯-1，2-丙二醇双棕榈酸酯-d5（d5-3-MCPD棕榈酸二酯，同位素纯度为98%），2-氯-1，3-丙二醇双硬脂酸酯（2-MCPD硬脂酸二酯，纯度98%），氘代同位素内标2-氯-1，3-丙二醇双硬脂酸酯-d5（d5-2-MCPD硬脂酸二酯，同位素纯度为98%）均购自加拿大TRC公司；1-（七氟正丁酰基）咪唑（HFBI，纯度97%）购自北京百灵威科技有限公司；甲醇钠（粉末状，纯度＞96.0%）购自东京化成工业株式会社；甲基叔丁基醚、石油醚（沸程为35～60 ℃）、乙醚、乙酸乙酯、正己烷、甲醇、冰乙酸均为色谱纯；无水乙醇、无水硫酸钠和氯化钠均为分析纯。硅藻土基质分散固相萃取柱（2 000 mg·45 mL-1）配制专用基质分散剂（3 g·袋-1）和高效脱水剂（15 g·袋-1）购自福州勤鹏生物科技有限公司。

1.3 标准溶液的配制

甲醇钠溶液：称取1.35 g甲醇钠溶解于50 mL甲醇中，用塑料瓶存放，4 ℃保存备用；溶解液：甲基叔丁基醚与乙酸乙酯以8∶2的体积比混合，用玻璃瓶存放，4 ℃保存备用；中和液：25 mL饱和氯化钠溶液中加入2.0 mL冰乙酸，混匀备用；乙醚经重蒸后得到无水乙醚备用。

标准储备液：分别准确称取1.00 mg 3-MCPD棕榈酸二酯、2-MCPD硬脂酸二酯、d5-3-MCPD棕榈酸二酯、d5-2-MCPD硬脂酸二酯标准品于10 mL容量瓶中，用乙酸乙酯溶解，定容至刻度线，混匀后得到浓度为100 μg·mL-1的单一标准储备液（均以其游离态3-MCPD、2-MCPD、d5-3-MCPD、d5-2-MCPD表示），于-20 ℃冰箱中保存备用。

混合标准工作液：重复上述步骤，稀释得到浓度为1.00 μg·mL-1的混合标准工作液（3-MCPD、2-MCPD）和1.00 μg·mL-1的混合内标工作液（d5-3-MCPD、d5-2-MCPD），于4～8 ℃冰箱中保存备用。

标准系列溶液：于5支离心管中各称取约0.10 g饱和氯化钠溶液，分别准确加入20、40、100、200、400 μL混合标准工作液（浓度为1.00 μg·mL-1），相当于20、40、100、200、400 ng的氯丙醇，以样品为0.10 g计算，相当于氯丙醇酯浓度分别为0.200、0.400、1.00、2.00、4.00 mg·kg-1（均以氯丙醇计）。再准确加入混合内标工作液（浓度为1.00 μg·mL-1）各60 μL，超声混匀后按1.4步骤进一步处理。

1.4 样品来源与分类

本次调查的76批次3类食品（油及其制品、谷物制品、特殊营养用食品）均从各大超市采集，包含大豆油、花生油、菜籽油、调和油、橄榄油、面包、饼干、糕点、方便面、麻花、油条、乳及乳制品、特殊膳食共13个品种。

1.5 样品的前处理

准确称取0.10 g脂肪样品，加入0.50 mL溶解液，再加入60 μL浓度为1.00 μg·mL-1的混合内标工作液，超声15 min后加入1.0 mL甲醇钠溶液，涡旋30 s，随后立即加入适量的中和液，控制pH为6.0～7.0，否则3-MCPD会部分转化为缩水甘油［13］，影响最后3-MCPD实际含量的测定；在上述水解液中倒入专用基质分散剂（3 g·袋-1），混匀后转移到硅藻土基质分散固相萃取柱（2 000 mg·45 mL-1）中，用30 mL正己烷淋洗，弃去此淋洗液，再用80 mL无水乙醚分多次洗脱，收集洗脱液于装有高效脱水剂（15 g·袋-1）的三角瓶中，然后过滤，并用10 mL 正己烷淋洗滤渣，收集滤液；滤液经旋蒸、氮吹后，用正己烷定容至约1.2 mL；随后，加入50 μL衍生剂HFBI，立即盖上磨口瓶塞涡旋，于75 ℃的电热恒温箱中衍生30 min；衍生结束后，冷却至室温，补加正己烷至1.2 mL，加入1 mL饱和氯化钠，充分涡旋后转移上层清液至装有适量无水硫酸钠的进样小瓶中，振摇后供GC-MS分析。

气相色谱条件：DB-5 MS 毛细管色谱柱（30 m×0.25 m×0.25 μm， Agilent）；进样口温度：280 ℃；程序升温：初始温度50 ℃，保持1 min，以2 ℃·min-1的速度升至90 ℃，再以40 ℃·min-1的速度升至280 ℃，保持5 min；载气为高纯度氦气，流速为1.0 mL·min-1；采用不分流进样模式，进样量为1 μL。

质谱条件：EI电离源；增益因子：15；电子倍增器电压：1 109 V；溶剂延迟时间：5 min；离子源温度：230 ℃；MS四极杆温度：150 ℃；采集类型：SIM模式；监测的定性离子和定量离子如表1所示。

表1 氯丙醇及其内标衍生物在GC-MS中的保留时间、定性离子和定量离子Table 1 Retention times, quantifier ion and qualifier ions for the derivatives of chloropropanols and internal standards by GC-MS

1.6 机构验证实验

5家机构用上述方法对已知本底值的油样进行加标回收实验，并同步进行FAPAS样品检测。

2 结果与分析

2.1 氯丙醇酯测定的质量保证与质量控制

将1.2中处理好的标准系列溶液按照1.5中的GC-MS条件进样分析，得到的总离子流色谱图（total ions chromatogram，TIC）如图1所示，两种氯丙醇及其内标衍生物分离度较好，且峰形尖锐，对称性好，目标物的保留时间以及定性、定量离子（表1）为后续实际样品中氯丙醇酯的测定提供了准确的定性依据。

图1 氯丙醇及其内标衍生物的总离子流图Fig. 1 Total ion chromatogram of the derivatives of chloropropanols and internal standards

处理好的标准系列溶液将混合标准和混合内标均进行了衍生操作，因此氯丙醇酯含量（均以游离态氯丙醇计）分别以对应的标准衍生物与其内标衍生物峰面积的比值来计算，得到的线性回归方程、相关系数及线性范围结果显示（表2），两种氯丙醇酯的检测在0.200～4.00 mg·kg-1范围内线性关系良好（R2＞0.999）。通常情况下，萃取-衍生技术联用GC-MS方法的检出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantitation，LOQ）分别以信噪比S/N=3［18］和S/N=10［27-28］计算得到，以此为依据，本方法3-MCPD酯的LOD和LOQ分别为0.042、0.140 mg·kg-1，2-MCPD酯的LOD和LOQ分别为0.058和0.193 mg·kg-1（表2）。进一步对6组空白样品进行加标回收实验，以回收率的均值表示方法的准确度，以测定实际结果的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）表示方法的精密度，由表3可知，3-MCPD酯和2-MCPD酯的平均回收率分别为98.9%和96.5%，两者的RSD分别为2.6%和4.3%，这表明此方法的精密度和准确度良好。

表2 应用方法的特征分析参数Table 2 The summary of analytical characteristics data of applied methodology

表3 回收率及标准偏差检测结果（n=6）Table 3 Results of recoveries and relative standard deviations (n=6)

2.2 方法验证

一方面，5家机构对该方法进行了协同验证，由结果可知（表4），两种氯丙醇酯在0.200～3.000 mg·kg-1范围内线性良好，LOD在0.030～0.058 mg·kg-1之间，加标的平均回收率在90.1%～104.9%之间，测定实际结果的相对偏差均小于10%，表明该方法的准确性和精密性良好；另一方面，5家机构利用该法测定了英国FAPAS能力验证样品，结果如表5所示，所有样品的测定结果均在合格范围之内，且平行样品之间的相对偏差均小于10%，进一步验证了该方法的可靠性。不同前处理方法的萃取条件、衍生条件、LOD、LOQ以及加标回收率的比较如表6所示，综合各方因素，固相萃取法（SPE）操作简便，实际消耗较少，实验结果能满足实际样品检测需要。

表4 不同检验机构之间方法验证结果Table 4 Results of verification by different inspection and research institutes

表5 不同检验机构测定FAPAS样的结果（n=3）Table 5 Results of detecting FAPAS samples by different inspection and research institutes (n=3)

表6 不同前处理方法的比较Table 6 Comparison of different pretreatment methods

2.3 实际样品中氯丙醇酯含量的调查

利用本方法对76批次的3类食品（油及其制品、谷物制品、特殊营养用食品）中氯丙醇酯的含量进行了调查。样品的前处理按照1.4的步骤进行，进样分析后，得到的结果如表7所示，3-MCPD酯的含量在0.042～4.865 mg·kg-1之间，平均 值 为0.773 mg·kg-1；而2-MCPD酯 的 含 量 在0.058～2.592 mg·kg-1之间，平均值为0.469 mg·kg-1，小于3-MCPD酯在这3类食品中的含量，主要是因为这些食品中的油和油脂是由具有高度特异性的原料在精炼过程中加工得到的［11］。

表7 常见食用油和含脂肪食品中3-MCPD酯和2-MCPD酯的含量Table 7 Content of 3-MCPD esters and 2-MCPD esters in edible vegetable oils and fatty food

由表1可知，在GC-MS分析中，对3-MCPD酯和2-MCPD酯进行检测的定量离子为289 m·z-1，3类食品提取该离子的色谱图，从图2中可以清晰地看到3-MCPD酯和2-MCPD酯的特征峰，说明3类食品中均含有这2种氯丙醇酯。

图2 3类食品的提取离子色谱图（289 m·z-1）Fig. 2 Extracted ion chromatogram (EIC, 289 m·z-1) of three kinds of food

对所调查的76份样品进行统计分析，结果如表8所示，其中，3-MCPD酯和2-MCPD酯的样本检出率分别为93.4%和98.7%，样本检出率较高，应引起高度重视。3类食品中氯丙醇酯含量的比较如图3所示，谷物制品中氯丙醇酯的含量最多，这是因为此类食品中的水分较少。研究表明，水分含量少于15%的食品中有较多的甘油存在［18］，甘油在热加工过程中与氯离子作用容易产生氯丙醇酯。

表8 全部所测样品中3-MCPD酯和2-MCPD酯含量的分布情况Table 8 Content distribution of 3-MCPD esters and 2-MCPD esters in all samples

图3 3类食品中3-MCPD酯和2-MCPD酯的含量Fig. 3 Content of 3-MCPD esters and 2-MCPD esters in three kinds of food

3 讨论

本文采用固相支持液-液萃取净化技术、衍生技术与气相色谱-质谱法相结合的检测方法，并将该方法成功运用在3类实际样品（油及其制品、谷物制品、特殊营养用食品）中氯丙醇酯含量的分析。所调查的76份样品中，3-MCPD酯和2-MCPD酯的样本检出率均高于90%，这为有关部门深入系统地采取措施提供了理论依据。实验过程中，方法的线性范围、检出限、定量限、加标回收率均能满足实际检测需要。此外，利用实验室间比对的方式验证了方法的准确度和精密度，通过测定英国FAPAS能力验证样品进一步证实了该方法的可靠性。以内标法定量，降低了实验操作过程中的损失，提高了方法的准确度和灵敏度，为该法广泛运用在工业生产的质量控制体系奠定了基础。目前，市场上食品中氯丙醇酯污染事件频发，我国对此类问题十分重视，相关检测方法的研究取得一定进展，各地食品安全风险监测项目的开展也为制定标准方法提供大量基础数据。但现有检测方法还存在缺陷，例如前处理步骤复杂、试剂消耗量大且易引起测定结果偏差、测定氯丙醇酯种类单一等，因此今后工作需进一步优化前处理方法，包括提取、水解、净化、衍生等，此外还需要将另两种氯丙醇酯，1，3-DCP酯和2，3-DCP酯一并列入未来研究计划中。