转基因抗虫作物鉴定质粒标准分子的构建与应用

王 颢 潜 ， 黄 炎 ， 石 雨 婷 ， 朱 鹏 宇 ， 谢 宇 宙 ， 黄 春 蒙 ， 卢 小 雨 ，付伟

1.农业农村部科技发展中心，北京 100176；

2.中国检验检疫科学研究院，北京 100176；

3.北京卫生职业学院，北京 101149；

4.中国标准化协会，北京 100048；

5.三亚中国检科院生物安全中心，海南 三亚 572025；

6.深圳海关动植物检验检疫技术中心，广东 深圳 518038

苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt）基因是常见的抗虫基因，存在于绝大多数的抗虫转基因作物中。自Bt抗虫基因被发现后，转Bt抗虫作物发展迅速，其中转Bt基因抗虫棉、抗虫大豆、抗虫玉米等转基因作物对抵抗害虫起到了巨大作用［1-2］。然而，随着转基因抗虫作物产业化应用步伐的加快，转基因生物安全监管任务面临着更大挑战，对转基因检测工作也提出了更高的要求。监管检测转基因抗虫作物的第一步就是对样品进行筛查，判断有无转基因成分。标准样品作为实物标准，对支撑检测工作的开展，确保检测结果的准确性、可靠性、有效性和可溯源性具有重要意义。转基因检测阳性标准样品的缺失将严重影响转基因产品的安全评价、身份验证、国内监管、进出口检验、企业自控和国际贸易互认等工作。

近年来，国内外在转基因产品检测中质粒标准分子构建方面的相关研究非常活跃，已报道的转基因产品检测质粒标准分子覆盖了多数大规模商业化的转基因作物［3］。质粒分子标准样品由一种含有外源基因片段和内标准基因片段的质粒分子制备而成［4］。与传统的基体标准样品相比，质粒标准分子通过微生物进行存储和大量培养，不依赖原材料，质粒DNA容易提取且纯度较高，可有效地解决阳性标准品匮乏和制备困难的问题，给检测工作带来便利，因此，也常被科研工作者研制成转基因产品成分检测的阳性标准对照样品［5］。自2008年国家转基因生物新品种培育重大专项成立以来，我国作为转基因生物研发和应用的大国，也正式启动了转基因产品检测标准样品研究工作，发布了关于基体标准样品候选物鉴定方法以及制备技术的标准和规范，初步建立了质粒标准样品的制备技术，并开展了质粒和基体标准样品定值技术方面的研究［6-8］。目前，国内已经研制出针对转基因玉米、大豆、油菜、马铃薯、水稻等多种作物检测用标准样品/标准物质［9-11］。

我国海关对转基因作物进口的相关法规较为严格，面对已经占据世界转基因作物市场且日益增加的转Bt基因作物，我国海关急需精确、简便的Bt基因检测手段，以便进一步加强我国对转Bt作物的监管。目前国内外所报道的针对Bt基因进行检测的阳性质粒标准分子主要是Cry1Ab和Cry1Ac基因，这2个基因无法对现阶段常见的转基因品系进行覆盖。因此，开发覆盖Bt基因更多的Bt阳性质粒标准分子对于转Bt基因植物的检测具有重要的实际意义。

本研究为满足境内转基因产品监管检测以及跨境转基因产品检测的需求，针对3种Bt基因Cry1Ab、Cry1Ac和Cry3A检测时所需要的阳性对照需求，人工合成了3种Bt基因序列，将序列克隆到质粒载体上，得到了可同时满足定性检测转Cry1Ab、Cry1Ac和Cry3A3种转基因外源基因成分的质粒标准分子。进一步验证质粒标准分子以及进行适用性分析，确保了本研究中Bt基因阳性标准样品能够满足转基因产品检测中的Cry1Ab、Cry1Ac和Cry3A基因qPCR筛选元件特异性检测的阳性对照需求。

1 材料与方法

1.1 实验仪器

恒温摇床、恒温培养箱、台式高速离心机、Genegenius凝胶成像分析仪、Eppendorf高速冷冻离心机、Eppendorf紫外分光光度计、电泳槽、超净工作台、-70 ℃超低温冰箱、涂布棒、剪刀、玻璃棒、天平、量筒、移液枪和温度计。

1.2 实验试剂

LB培养基、琼脂糖、100 mg·mL-1氨苄青霉素、LB液体培养基、10×T4 DNA ligase buffer，2×TaqMan universal master mix、EcoR V和HindⅢ限制性内切酶、琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒、QIAfilter plasmid midi kits质粒提取试剂盒。

1.3 质粒DNA分子的构建和提取

本研究以海关技术规范《植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法》（SN/T1204—2016）中3种Bt基 因Cry1Ab、Cry1Ac、Cry3A作为构建标准质粒标准分子的靶标序列，将3种内标准基因的靶标序列拼接到一起，长328 bp，采用基因合成技术人工合成目的序列，然后将pUC57质粒用平端酶EcoR V酶切，通过平端连接克隆，构建了阳性质粒标准分子，最后将构建的质粒转入E. coliDH5α感受态细胞中，便于保存与扩繁质粒DNA。

1.4 阳性质粒标准分子的验证

1.4.1质粒DNA纯度与浓度测定 通过紫外分光光度法（Nanodrop 2000）测定pUC57-Cry质粒DNA的A260/A280值。实验中质粒DNA的A260/A280应为1.8～2.0，A260/A230为2.0～2.3。

1.4.2酶切验证 取1 μL质粒DNA样品，采用Hind Ⅲ限制性内切酶酶切质粒，酶切体系为：HindⅢ酶2 μL，酶切缓冲液2 μL，质粒DNA 14 μL，去离子水补足20 μL。37 ℃下水浴3 h后用1 %琼脂糖凝胶电泳检测，根据条带大小对质粒片段加以验证。

1.4.3测序验证 将构建的阳性质粒分子转入大肠杆菌中，摇菌培养后提取的质粒交擎科生物有限公司测序，对测序结果采用EBI软件进行比对分析，验证序列的正确性。

1.4.4实时荧光PCR扩增功能验证 按照《植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法》（SN/T1204—2016）对3种外源元件进行实时荧光PCR扩增已验证质粒的可用性。扩增体系为：50 ℃预变性2 min；95 ℃变性10 min，60 ℃退火延伸60 s，40个循环；在退火延伸阶段进行荧光信号采集。检测体系为：2×TaqMan Universal Master Mix 10 μL， 上下游引物（10 μmol·L-1）各1 μL，探针（10 μmol·L-1，0.5 μL）质粒DNA模板2 μL，ddH20补足至20 μL，3种外源元件的引物探针如表1所示。

表1 实时荧光PCR筛查体系Table 1 Real-time fluorescent PCR screening system

1.5 阳性质粒标准分子适用性测试

1.5.1阳性质粒标准分子Bt基因扩增效率测试与适宜稀释浓度分析 本研究用去离子水将质粒原液稀释成8个浓度梯度（100倍～107倍），分别绘制3个Bt基因的标准曲线，依据《植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法》（SN/T1204—2016）对3个目标Bt基因进行实时荧光PCR扩增，然后根据质粒模板拷贝数的对数与Ct值间的对应关系绘制3个目的基因的标准曲线，测试其扩增效率。同时根据不同稀释浓度的qPCR扩增Ct值确定质粒合适的稀释倍数，将质粒用去离子水稀释。

1.5.2阳性质粒标准分子实际样品检测应用测试 为了测试Bt阳性质粒标准分子在转基因产品成分检测中的实际应用效果，本研究选取了转Bt基因玉米MON810（Cry1Ab）、DBT418（Cry1Ac）、MIR604（Cry3A）、转基因玉米品系MON88017（不含Cry1Ab、Cry1Ac与Cry3A基因）以及送检的未知玉米样品作为研究材料，并依据海关技术规范《植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法》（SN/T1204—2016）对不同样品分别进行3个目标Bt基因的实时荧光PCR扩增。采用天根植物基因组提取试剂盒提取了转Bt基因玉米与经检测鉴定的未转入Bt基因的非转基因玉米的基因组DNA，作为基体标准物质阳性对照和阴性对照模板，选用本研究制备的质粒样品作为阳性对照模板，然后按照海关技术规范《植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法》（SN/T1204—2016）中的qPCR程序以及相应的引物探针，对1组质粒阳性对照、3组转Bt基因玉米基因组DNA阳性对照、1组MON88017（不含Cry1Ab、Cry1Ac与Cry3A基因）阴性对照和1组未知样品进行针对3个Bt基因靶标的荧光PCR扩增，每个样品重复3次。检测体系同1.4.4，3种外源元件的引物探针如表2所示。

表2 3种Bt基因引物和探针序列Table 2 Three Bt gene primers and probe sequences

2 结果与分析

2.1 阳性质粒标准分子的构建与验证

将长约328 bp的靶标序列克隆到pUC57质粒上，命名为pUC57-Cry。将构建好的质粒转化至E. coliDH5α感受态细胞中，使用氨苄青霉素筛选出阳性克隆，并通过菌液的培养得到了大量纯化质粒。

2.1.1质粒DNA纯度与浓度测定结果 利用紫外分光光度法（Nanodrop2000）测定pUC57-Cry质粒标准样品的A260/A280值为1.88 ± 0.01，介于1.8～2.0，A260/A230值大于2.0，浓度为76.1 ± 0.2 ng·μL-1，表明样品纯度符合要求，利用QIAfilter plasmid midi kits试剂盒提取的质粒DNA纯度高，能够满足大批量制备阳性质粒样品。

2.1.2酶切验证结果 酶切结果如图1所示，通过Hind Ⅲ限制性内切酶酶切获得了与预期序列大小一致的单一条带（约3 000 bp），条带清晰明亮，且无杂带和RNA条带，说明提取的质粒DNA质量高。

图1 pUC57-Cry质粒酶切验证结果Fig. 1 The results of molecular digestion of pUC57-Cry plasmid

2.1.3测序验证结果 测序所得序列与构建的序列采用EBI软件比对，结果如图2所示，序列的匹配率为100%，进一步验证了质粒载体中目的序列的正确性。

图2 测序序列与目的序列比对图Fig. 2 EBI software compares the sequencing sequence with the target sequence diagram

2.1.4实时荧光PCR扩增功能验证结果 3种Bt基因Cry1Ab、Cry1Ac与Cry3A特异性序列qPCR扩增均产生典型扩增曲线，扩增Ct值如表3所示，结果均为阳性，说明构建的pUC57-Cry质粒具有预期扩增功能，能满足出入境海关技术规范《植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法》（SN/T1204—2016）荧光PCR扩增要求。

表3 pUC57-Cry质粒3种外源基因qPCR扩增Ct值Table 3 The Ct values of the three exogenous genes of pUC57-Cry plasmids amplified by qPCR

2.2 阳性质粒分子适用性测试结果

2.2.1阳性质粒标准分子Bt基因扩增效率测试与适宜稀释浓度分析结果 如图3所示，以梯度稀释的阳性质粒样品建立的标准曲线相关线性系数均在0.99以上，线性系数良好，标准曲线的斜率在-3.1～-3.6之间，即扩增效率在90%～110%，标准曲线的各项技术参数均在可接受范围内，符合标准对实时荧光PCR扩增效率的要求。扩增效率测试结果表明，以质粒标准分子作为海关技术规范《植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法》（SN/T1204—2016）中要求的阳性对照，采用标准中的实时荧光PCR标准方法能正常扩增，本研究制备的质粒样品适合用作转Bt基因产品成分检测鉴定的实时荧光PCR阳性对照。

图3 阳性质粒靶基因的扩增标准曲线Fig. 3 Amplification standard curve of positive plasmid target gene

梯度稀释后的qPCR扩增Ct值结果显示，除106倍和107倍稀释外，其余各个稀释梯度3个基因的扩增Ct值均小于35，符合海关技术规范《植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法》（SN/T1204—2016）中对于阳性对照荧光PCRCt值的要求（小于35）。为了稳定保存标准样品，本研究将质粒用去离子水稀释100倍（Ct值20左右）。基于本研究的验证结果，在实际检测过程中，实验中研制的的标准样品在稀释100～1 000倍后，仍可以作为检测Cry1Ab、Cry1Ac与Cry3A3种外源基因的阳性对照使用。

2.2.2阳性质粒标准样品实际样品检测应用测试 荧光PCR扩增结果显示（表4），转Bt基因玉米MON810（Cry1Ab）、DBT418（Cry1Ac）、MIR604（Cry3A）与阳性质粒分子的3个靶标均出现了典型的扩增曲线，而送检的未知玉米样品与转基因玉米品系MON88017（不含Cry1Ab、Cry1Ac与Cry3A基因）中3种靶标均未出现扩增曲线，根据海关技术规范《植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法》（SN/T1204—2016）中的要求，该实验结果说明送检的未知玉米样品不含有3种Bt基因。基因组阳性对照与质粒阳性对照的结果说明，pUC57-Cry质粒阳性对照可以替代相应基因组作为阳性对照，同时减少了基因组的提取步骤，操作更加简便。

转基因产品实时荧光PCR成分定性检测应用测试结果表明，海关技术规范《植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法》（SN/T1204—2016）可用pUC57-Cry质粒分子作为检测转基因植物及其加工产品是否含有Cry1Ab、Cry1Ac与Cry3A基因成分时的阳性对照。本研究制备的pUC57-Cry阳性质粒适用于转Cry1Ab、Cry1Ac与Cry3A基因产品实时荧光PCR鉴定检测的质控样品。

3 讨论

现阶段，转基因检测用的标准品样品主要有3种形式：基体标准样品、基因组标准样品和质粒标准样品。其中基体标准样品为直接通过研磨植物种子或叶片制备而成的标准样品，不仅可以对PCR流程提供阳性质控，同时也可以对样品的核酸提取部分提供质控，是适用性最强的标准样品类型。但是，目前转基因检测用基体标准样品的研制方主要为IRMM、AOCS等国际组织，使用成本高，样品获取困难，通常从订购到实验需要半年以上时间，这极大地限制了基体标准样品在实际工作中的应用［12-14］。基因组标准样品通过阳性粉末提取基因组而来，在使用阶段虽然不能质控核酸的提取步骤，但是使用简单，无需提取可直接作为阳性对照添加，靶标质控范围广，可以涵盖转基因检测的各个靶标。但是由于核酸的不稳定性，这一类的标准样品对运输条件以及核酸浓度的要求极为苛刻，容易受到运输以及储存过程中的影响而导致标准样品失效。质粒标准样品是3种标准样品中制备最为灵活、最不受转基因样品影响的标准样品种类，由于其产品性质简单，且在分子生物学层面上可操作性较强，可以通过重组插入多种外源序列，因此，质粒标准样品已经逐渐成为转基因产品检测用标准样品的重要组成部分［14-18］。近年来，针对转基因品系的重组质粒标准品不断问世，通过完善的特性值验证、均匀性和稳定性验证，质粒标准样品也可以在转基因产品检测端发挥巨大作用［19］。

转基因检测标准是转基因产品检测的基石，目前，在境内转基因产品监测以及口岸跨境转基因产品成分检测中［20］，海关技术规范《植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法》（SN/T1204—2016）具有广泛的应用范围。Bt基因是转基因作物中常见的外源功能基因，由于Bt序列的可变性较强，Bt基因检测中的阳性对照经常会出现假阴性结果。因此，配套开发可以满足该标准的转基因检测Bt基因组合质粒标准样品对于进一步完善转基因检测标准化体系具有重要意义。

本研究在转基因产品成分检测实际需求的基础上，以海关技术规范《植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法》（SN/T1204—2016）中3种Bt抗虫基因作为靶序列，克隆到载体而得到了含有3种Bt基因的质粒阳性对照，经过一系列的质粒验证与适用性测试，结果表明本研究制备的pUC57-Cry阳性质粒满足海关技术规范《植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法》（SN/T1204—2016）中的相关检测要求，能够替代相应的基因组DNA阳性对照而作为转Cry1Ab、Cry1Ac和Cry3A基因产品基因特异性qPCR定性检测的阳性对照。