抗菌肽BCp12保鲜膜在乳扇贮藏保鲜中的应用

杨婷婷，杨 婧，袁子又，赵 琼，杨 昆，黄艾祥

（云南农业大学食品科学技术学院，云南 昆明 650201）

近年来，食品安全问题引起人们的广泛关注，其中微生物污染可能会导致食源性疾病，威胁人体健康，因此预防和控制食品微生物污染尤为重要。乳品营养价值丰富，是人们的生活必需品，其中常见的致病菌有金黄色葡萄球菌和大肠杆菌等[1]。乳扇是云南地区的传统乳制品，深受人们的喜爱，但目前乳扇主要以小型作坊和手工艺生产为主，易发生微生物污染，带来食品安全问题。同时乳扇是高脂肪、高蛋白食品，贮存期短且容易因氧化变质出现发酸、哈喇味及表面霉变。目前市售乳扇多以真空包装为主，此方法对乳扇保鲜具有一定效果，如肖梦林等[2]采用真空包装、巴氏杀菌、涂抹保鲜剂处理乳扇，其中真空包装的保鲜效果较好；肖蓉等[3]在制作乳扇的鲜乳中加入山梨酸钾，并将乳扇成品真空包装，此工艺可使乳扇保鲜期达到1 年。真空包装虽然保鲜效果较好，但成本较高，因此，具有对人体无害、抗菌、绿色环保及延长食品货架期等优点的可食性抑菌膜成为了当今国内外研究的热点[4]。目前，应用最多的天然高分子材料通常是蛋白质类、多糖类及复合类[5]。

与普通保鲜膜相比，天然保鲜膜具有可食、安全等优点，具有很高的应用价值。壳聚糖是仅次于纤维素的第二大可再生多糖，属于天然可再生资源[6-7]，具有抗菌性、生物相容性和无毒性等优点，可用于研制食品包装材料[8-9]，是研究和应用最广泛的可食膜材料之一。此外壳聚糖常与海藻酸钠、月桂酰精氨酸乙酯复配后用于食品（如番茄[10]、车厘子[11]等）保鲜。酪蛋白具有耐热、可乳化、可食用等特点，因此其可用于制备食品包装薄膜[12-13]。但由于酪蛋白自身的亲水性及不具备抗菌性，其成膜后的性能有待提高。有研究表明，壳聚糖、酪蛋白复配使用可提高酪蛋白的溶解性及成膜性[14]。抗菌肽是高等真核生物中先天免疫系统的重要组成部分，一般含有100 个以下氨基酸残基或有广谱抑菌活性的小分子多肽，其有抗病毒、抗菌甚至抗癌细胞等多种活性功能[15-16]。在前期研究中，Zhao Qiong等[17]从槟榔江水牛奶酪蛋白中分离了新型抗菌肽BCp12，该肽序列为YLGYLEQLLRLK，分子质量为1508.82 Da，具有低毒性且对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增多性李斯特氏菌和鼠伤寒沙门氏菌4 种食源性致病菌的生长均有抑制作用。此外，李钰芳[18]、杨昆[19]等研究也发现BCp12能够显著抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的生长。目前，将抗菌肽、壳聚糖与酪蛋白复配保鲜膜应用于乳扇保鲜的研究鲜有报道。基于此，本实验优化BCp12/壳聚糖/酪蛋白复合膜制备工艺，研究其机械性能和抑菌效果，同时通过微观结构、分子对接考察复合膜的相容性及活性位点，并将其应用于乳扇保鲜，为BCp12/壳聚糖/酪蛋白复合膜在食品保鲜方面的应用提供理论依据，同时促进抗菌肽在食品保鲜方面的应用。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及病原菌

抗菌肽BCp12（纯度＞95%） 安徽国平药业有限公司合成。

金黄色葡萄球菌CICC 10384、大肠杆菌CICC 10003中国工业菌种保藏中心；乳扇 云南省大理州陶记乳扇；酪蛋白酸钠 北京索莱宝科技有限公司；壳聚糖（食品级） 河南双腾实业有限公司。

1.2 仪器与设备

CR-400/410色彩色差仪 深圳大略电子仪器有限公司；HD-3A水分活度测定仪 厦门市弗布斯检测设备有限公司；Nicolet iS10傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy，FT-IR）仪 美国赛默飞世尔科技公司；FlexSEM 1000扫描电子显微镜（scanning electron microscopy，SEM） 日本日立高新公司；Haloes Calipe抑菌圈测量仪 西班牙IUL公司。

1.3 方法

1.3.1 酪蛋白/壳聚糖/BCp12复合膜的制备

参考文献[20]的方法，取3.0 g壳聚糖溶于1 mL质量分数1%冰乙酸溶液中，并加入质量分数1.5%甘油，磁力搅拌30 min后制成壳聚糖溶液。接着，配制质量分数2%酪蛋白酸钠溶液磁力搅拌30 min使其溶解，然后加入壳聚糖溶液混匀并搅拌6 h得到酪蛋白/壳聚糖膜液，随后加入质量分数1%的BCp12溶液，于40 ℃水浴加热搅拌6 h，然后超声脱气30 min，即得到BCp12/壳聚糖/酪蛋白复合膜液，最后将膜液流延成膜，放入烘箱烘干备用。

1.3.2 单因素试验

参照1.3.1节方法制备酪蛋白/壳聚糖/BCp12复合膜，以酪蛋白/壳聚糖比例（质量比，下同）、甘油质量分数、干燥温度为单因素，考察每个单因素对复合膜机械性能（复合膜拉伸强度和断裂伸长率）的影响。分别按照1.3.1节方法配制20 mg/mL酪蛋白溶液和20 mg/mL壳聚糖溶液，研究不同的酪蛋白/壳聚糖比例（2∶1、1.5∶1、1∶1、1∶1.5和1∶2）、甘油质量分数（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%）、干燥温度（45、50、55、60 ℃和65 ℃）复合膜机械性能。测定每个单因素时，其他因素固定为酪蛋白/壳聚糖比例1∶1.5，甘油质量分数为1.5%，干燥温度为55 ℃。

1.3.3 正交试验设计

采用3因素3水平正交试验确定酪蛋白/壳聚糖/BCp12复合膜的最佳工艺，酪蛋白/壳聚糖比例为A因素、甘油质量分数为B因素、干燥温度为C因素，按照正交试验设计（表1）和1.3.1节方法制备酪蛋白/壳聚糖/BCp12复合膜，并考察复合膜的机械性能。

1.3.4 复合膜机械性能测定

参照文献[21]和GB/T 1040.3-2006《塑料 拉伸性能的测定 第3部分：薄塑和薄片的试验条件》，利用质构仪测定复合膜机械性能。采用厚度测量仪在复合膜上取9 个点进行厚度测量，取平均值。抗拉强度按式（1）计算，断裂伸长率按式（2）的计算。

式中：F为复合膜断裂时的最大张力/N；b为复合膜宽度/mm；d为复合膜厚度/mm。

式中：L1为复合膜断裂时的伸长长度/mm；L0为复合膜的初始长度/mm。

1.3.5 不同质量浓度BCp12复合膜厚度的测定

根据1.3.3节优化后的工艺采用不同质量浓度（0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）BCp12制备酪蛋白/壳聚糖/BCp12复合膜，复合膜厚度使用螺旋测微器测量，每个样品任意选取5 个点，结果取平均值。选取1.0 mg/mL BCp12复合膜观察微观形态和FT-IR分析。

1.3.6 复合膜的微观形态观察

将壳聚糖膜、壳聚糖/BCp12及酪蛋白/壳聚糖/BCp12复合膜膜液的冻干粉在金属样品台上干燥，真空条件下喷金30 s后，将处理好的待测样品于扫描电子显微镜下观察，加速电压7.00 kV。

1.3.7 复合膜的傅里叶变换红外光谱分析

取BCp12、壳聚糖/BCp12、酪蛋白/BCp12和酪蛋白/壳聚糖/BCp12复合物冻干后进行FT-IR分析，分辨率4 cm－1，扫描范围400～4000 cm－1。

1.3.8 分子对接

使用AutoDock vina 1.1.2软件通过分子对接法分析壳聚糖、酪蛋白和BCp12的结合方式[22]。从蛋白质结构数据库（https://www.rcsb.org/）中下载酪蛋白、BCp12的晶体结构，从PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下载壳聚糖的3D结构（SDF格式），用ChemBio3D Ultra 14.0软件绘制壳聚糖、酪蛋白和BCp12的结构进行加氢处理。从蛋白质结构数据库中得到CSN1S1、CSN1S2、CSN2和CSN3酪蛋白4 种蛋白的X射线晶体结构，保存为pdbqt格式。然后将酪蛋白、壳聚糖的小分子导入AutodockTools-1.5.6软件包进行加氢处理并计算晶体结构和最低能量，其将设置成对接的相互作用位点，利用AutoDockTools 1.5.6软件包生成对接输入文件。挑选出结合能最低的复合物为最有利的结合方式，并采用Pymol 2.3.0软件将对接结果可视化。

1.3.9 BCp12复合膜液及复合膜的抑菌实验

参考文献[23]的方法，将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在37 ℃培养箱中培养24 h，无菌生理盐水稀释至106个/mL备用。取0.15 mL菌液涂布在LB琼脂固体培养基上，然后用打孔器在每个平板的打5 个孔并编号1～5，每孔加入25 μL不同溶液或膜液：在1号孔（左上角）加入20 mg/mL酪蛋白溶液，在2号孔（右上角）加入酪蛋白/壳聚糖比例1∶1.5、甘油质量分数1.5%的复合膜液，在3号孔（左下角）加入1.0 mg/mL BCp12/酪蛋白/壳聚糖膜液，在4号孔（右下角）加入20 mg/mL壳聚糖溶液，在5号孔（中心）加入无菌去离子水，37 ℃培养18 h，观察不同膜液或溶液的抑菌效果并拍照。类似地，在打孔后的LB琼脂板中每孔加入25 μL含不同质量浓度（0（对照）、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）BCp12的BCp12/壳聚糖/酪蛋白膜液；将1.3.5节制备的含不同质量浓度（0（对照）、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）BCp12的复合膜裁成直径1 cm的圆形，贴在打孔后的LB琼脂板上。将其置于恒温培养箱37 ℃培养18 h，以不含BCp12的膜液和复合膜作为空白组，37 ℃培养箱中培养18 h，实验设置3 个平行。观察并统计抑菌圈的直径，评价抗菌效果。

1.3.10 复合膜对乳扇的保鲜作用

1.3.10.1 乳扇的处理

将乳扇样品在无菌条件下剪成6 cmh 1.5 cm的长方形（质量为1 g），覆盖复合膜（边长8 cm正方形）后分为对照组、1组（壳聚糖/酪蛋白复合膜）、2组（壳聚糖/酪蛋白复合膜＋1 mg/mL Nisin）、3组（壳聚糖/酪蛋白复合膜＋1 mg/mL BCp12）4 个组，对照组不做任何处理。将普通薄膜剪成边长5 cm的正方形，将已覆有复合膜的乳扇用普通膜覆盖避免污染，置于4 ℃冰箱贮藏60 d。

1.3.10.2 感官评定

挑选10位评价人员组成评定小组按照表2对不同贮藏时间（0、10、20、30、40、50、60 d）的乳扇色泽、滋味和气味、组织状态进行评分，最终结果取3 个项目的平均分。

表2 感官评定标准Table 2 Criteria for sensory assessment of milk fan

1.3.10.3 过氧化值的测定

参考GB 5009.227-2016《食品安全国家标准 食品中过氧化值的测定》测定不同贮藏时间（0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 d）乳扇的过氧化值。

1.3.10.4 色泽的测定

采用色彩色差仪测定各不同贮藏时间（0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 d）乳扇的L*值（亮度）、b*值（黄度），每组随机采点测定3 次，结果取平均值。

1.3.10.5 菌落总数的测定

参考GB 4789.21016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》测定不同贮藏时间（7、21、35、49、63 d）乳扇的菌落总数。

1.4 数据统计与分析

实验重复3 次，结果以平均值±标准差表示。采用Design-Expert 10软件进行正交试验结果分析，采用SPSS Statistics 26软件进行Duncan多重比较，P＜0.05表示差异显著。采用Origin 8.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 酪蛋白/壳聚糖/BCp12复合膜机械性能的单因素试验结果

2.1.1 酪蛋白/壳聚糖比例对复合膜机械性能的影响

由图1可知，随着壳聚糖含量的增加，复合膜的拉伸强度先增大后减小，当酪蛋白与壳聚糖的比例为1∶1时，拉伸强度达到最大值。壳聚糖上的游离氨基和羟基与酪蛋白分子之间存在氢键作用，当用磁力搅拌器充分混合时，二者可在分子水平上产生物理交联，所以复合膜的强度较好[24-25]。酪蛋白与壳聚糖的比例为1∶1.5时断裂伸长率最大，但随壳聚糖比例的增加而降低。这可能是壳聚糖浓度过大，二者相容性变差，导致复合膜的拉伸强度和断裂伸长率均下降。壳聚糖本身是亲水分子会与其他成膜分子形成氢键作用力，亲水效应增强。因此，后续实验制备复合膜选择酪蛋白/壳聚糖比例为1∶1.5。

图1 酪蛋白/壳聚糖比例对复合膜拉伸强度（A）和断裂伸长率（A）的影响Fig.1 Effect of casein/chitosan ratio on tensile strength (A) and elongation at break (B) of composite films

2.1.2 甘油质量分数对复合膜机械性能的影响

甘油可以作为增加复合膜相容性和可塑性的增塑剂，对提高其力学性能有重要影响[26]。如图2所示，随着甘油质量分数增大，拉伸强度呈下降趋势，而断裂伸长率呈上升趋势。拉伸强度下降是由于甘油过多进入膜分子内部，破坏了原来的分子结构，增大了分子链的间隙，导致膜分子致密性下降。而甘油可使酪蛋白和壳聚糖分子之间产生氢键作用并软化高聚物的刚性结构，使得高聚物链段的流动性增加，断裂伸长率增加。这与张一妹[27]和曾丽萍等[28]的研究结果一致。此外，甘油分子在基材中不易挥发，甘油过多会使复合膜表面的甘油溢出，影响感官品质。甘油本身为亲水物质，易进入分子内部与成膜分子间形成新的氢键结构，进一步使膜的流动性和保水性增加[29]。因此，后续实验制备复合膜选择甘油质量分数为1.5%。

图2 甘油质量分数对复合膜拉伸强度（A）和断裂伸长率（B）的影响Fig.2 Effect of glycerol concentration on tensile strength (A) and elongation at break (B) of composite films

2.1.3 干燥温度对复合膜机械性能的影响

从图3可以看出，拉伸强度和断裂伸长率随着干燥温度的升高呈先升高后降低的趋势，拉伸强度受温度影响较明显，断裂伸长率在55 ℃以下变化缓慢，干燥温度高于55 ℃时迅速下降。当干燥温度上升时，溶剂蒸发留下的孔穴过多，造成复合膜的结构缺陷和裂缝，故其拉伸强度和断裂伸长率差，而低温条件下形成的复合膜结构更致密、性能较好，该结果与方健[30]的研究结果相似。在此温度下，水分蒸发速率较适中，壳聚糖分子在膜基质形成过程中可以有序排列，致密性较高，持水性也较好[25]。因此，后续实验制备复合膜选择55 ℃为最佳干燥温度。

图3 干燥温度对复合膜拉伸强度（A）和断裂伸长率（B）的影响Fig.3 Effect of drying temperature on tensile strength (A) and elongation at break (B) of composite films

2.2 酪蛋白/壳聚糖/BCp12复合膜机械性能的正交试验优化结果

如表3所示，通过极差分析可知，以拉伸强度为考察指标，影响复合膜机械性能的主次顺序为C＞A＞B，即干燥温度对复合膜的拉伸强度影响最大，甘油质量分数影响最小。以断裂伸长率为考察指标，影响复合膜机械性能的主次顺序为A＞C＞B，即酪蛋白/壳聚糖比例对复合膜的断裂伸长率影响最大，甘油质量分数影响最小。9 个正交试验条件中的最佳工艺组合为A2B1C2，由极差分析得到的最佳工艺组合为A2B3C2和A1B1C2。

表3 正交试验结果Table 3 Orthogonal array design with experimental results

由R值可知，拉伸强度中C干燥温度的影响更为显著，因此选择拉伸强度中C因素的较优水平为55 ℃；断裂伸长率指标中A的影响最显著，因此选择断裂伸长率中A因素的较优水平为1∶1.5。正交试验方差分析结果如表4、5所示，通过F值可知，各因素对复合膜机械性能的影响顺序为酪蛋白/壳聚糖比例＞干燥温度＞甘油质量分数，即酪蛋白/壳聚糖比例对复合膜机械性能的影响最大，甘油质量分数影响最小。综合考虑得出最优成膜工艺为A2B2C2，即酪蛋白/壳聚糖比例1∶1.5、甘油质量分数1.5%、干燥温度55 ℃，以此条件制备的复合膜拉伸强度为（14.86f 0.35）MPa、断裂伸长率为（142.25f 0.11）%，以此工艺进行后续实验中复合膜的制备。

表4 拉伸强度方差分析结果Table 4 Analysis of variance for tensile strength

表5 断裂伸长率方差分析结果Table 5 Analysis of variance for elongation at break

2.3 不同质量浓度BCp12复合膜的厚度

由图4可知，酪蛋白/壳聚糖/BCp12复合膜厚度随BCp12质量浓度的增加而增加，其范围为12～54 μm。这可能是由于提高抗菌肽质量浓度加强了分子间的紧密连接。BCp12质量浓度越高，膜液中固形物含量越多，复合膜的结构越紧密，成膜厚度逐渐增加。因此，复合膜的机械性能随BCp12质量浓度增大而逐渐增大。后续实验制备复合膜选择抗菌肽质量浓度为1.0 mg/mL。

图4 抗菌肽BCp12质量浓度对复合膜厚度的影响Fig.4 Effect of antimicrobial peptide BCp12 concentration on thickness of casein-chitosan composite films

2.4 SEM观察结果

复合膜的抗拉强度、断裂伸长率和水蒸气透过系数是由组成膜的大分子决定的。这些大分子成膜时是否均匀或完全溶解将直接影响可食膜的性质。由图5A可知，壳聚糖膜表面光滑致密平整，表明膜内部结构均匀，这与曾少甫等[31]研究发现壳聚糖膜表面质地光滑和结构紧凑的结果一致。加入抗菌肽BCp12后，壳聚糖膜表面开始出现孔隙（图5B），这可能是由于BCp12进入壳聚糖内部，冷冻干燥成膜粉后生成的小孔。由图5C可见蛋白质颗粒且表面较粗糙，膜中出现孔隙和区块的现象，说明BCp12可能负载在复合膜上[32]。结合抗拉强度和断裂伸长率分析结果可知，添加抗菌肽可能会使复合膜内部出现孔隙[33]，导致复合膜的抗拉强度和断裂伸长率下降。本实验结果与Mohajer等[34]的研究结果类似，说明BCp12可与酪蛋白、壳聚糖混合使用，3 种物质具有良好的相容性。主要是由于分子链间形成氢键相互作用，一定程度上增加了水分子的透过性并形成了致密的网络结构[35]。

2.5 FT-IR分析结果

由图6A、B可知，BCp12在1656.86 cm－1处特征吸收峰对应酰胺I带C＝O伸缩振动，1440.60 cm－1处特征吸收对应酰胺II带，1314.96 cm－1处特征吸收峰对应酰胺III带，1182.63 cm－1处特征吸收峰对应C-O伸缩振动；而壳聚糖/BCp12在1630.05 cm－1处的吸收峰对应酰胺I带C＝O的伸缩振动，1455.10 cm－1处特征吸收峰对应酰胺II带，1320.93 cm－1处特征吸收峰对应酰胺III带，1157.75 cm－1处特征吸收峰对应C-O伸缩振动[36]。根据沈亚丽[37]的研究，壳聚糖在1436 cm－1处特征吸收峰对应O-H和N-H的伸缩振动，1642 cm－1处特征吸收峰对应酰胺I带C＝O的伸缩振动。而壳聚糖/BCp12的FT-IR图中缺少了1602 cm－1附近的特征吸收峰，使其峰面积变宽并向低波数移动，说明壳聚糖/BCp12内存在氢键作用。

由图6C、D可知，酪蛋白/BCp12在1642.15 cm－1处吸收峰对应的是酰胺I带C＝O的伸缩振动，1446.56 cm－1处吸收峰对应酰胺II带，1314.63 cm－1处吸收峰对应酰胺III带，1172.06 cm－1处吸收峰对应C-O伸缩振动。根据沈亚丽[37]的研究，壳聚糖在N-H弯曲振动吸收峰为1602 cm－1，BCp12/酪蛋白/壳聚糖复合膜的吸收峰为1545.67 cm－1，由于膜内的氨基发生质子化，形成了NH，说明添加BCp12使该吸收峰向低波数方向移动。酪蛋白/壳聚糖/BCp12复合物中C-O伸缩振动峰向低波数方向移动且峰强度提升，这是由于基团间形成了氢键，使伸缩振动向低波数移动。Huang Guoqing等[38]利用FT-IR研究大豆分离蛋白和壳聚糖复合使用也得到类似的结论。

图6 BCp12、壳聚糖/BCp12、酪蛋白/BCp12和酪蛋白/壳聚糖/BCp12复合膜的FT-IRFig.6 FT-IR spectra of BCp12,BCp12/chitosan,BCp12/casein and BCp12/chitosan/casein composite films

与BCp12/酪蛋白膜相比，BCp12/酪蛋白/壳聚糖复合膜的特征峰几乎均向低波数偏移，但未超过BCp12/壳聚糖的特征峰波数。研究表明，若两种水性高分子相容性较好，分子间氢键相互作用会加强，表现为羧基振动峰向低波数方向偏移[39]，形成分子内氢键会使吸收强度增加并变宽。因此，可得到BCp12/酪蛋白/壳聚糖复合膜内部存在较强的氢键作用，膜成分中会引入更多亲水性基团，使之具有良好的相容性且保水性和吸水性增强，这与张立挺等[40]的研究结果类似。

2.6 分子对接结果

分子对接在结构分子生物学研究中有着广泛的应用，通过计算机模拟等方法可以预测主要蛋白与活性物质间的结合位点及作用方式[41]。由图7可知，CSN1S1、CSN1S2、CSN2和CSN3酪蛋白均能较好地对接于BCp12的活性中心位点，其中，CSN1S1酪蛋白的残基Q112、Y109、K118与BCp12的残基Y1、Y4、Q7、K12之间通过—NH2、—C＝O、—OH形成5 个氢键，最低结合能为－26.4 kJ/mol。与CSN1S1酪蛋白相比，CSN1S2酪蛋白的残基E66、A62与BCp12的残基L2、G3、Y4之间存在3 个氢键且长度为3.0 Å。并且CSN2酪蛋白的残基Q138、K128与BCp12残基的L8、L9之间存在2 个氢键且结合能为－127.6 kJ/mol。而CSN3酪蛋白残基的G20、P115与BCp12残基的Y1、Y4之间存在2 个氢键且结合能为－94.5 kJ/mol。表明4 种酪蛋白残基均能与BCp12残基形成氢键相互作用，在分子的吸引中起重要作用，并且容易引起成膜分子间的聚集，使膜中引入更多亲水性氨基酸残基，膜的吸水性增强[42]。有研究表明抗菌肽HHRRFSLY可杀死大肠杆菌、破坏细胞膜和蛋白构象，这可能与细胞的外膜选择性渗透有关[43]。因此，可以推测BCp12的残基Y4和酪蛋白之间通过—NH2形成氢键作用引起复合膜成分的聚集，使其具有低结合能、结构稳定性、保水性和抗菌性。

图7 CSN1S1酪蛋白-壳聚糖（A）、CSN1S2酪蛋白-壳聚糖（B）、CSN2酪蛋白-壳聚糖（C）和CSN3-酪蛋白-壳聚糖（D）的分子对接结果Fig.7 Molecular docking diagrams of CSN1S1 casein-chitosan (A),CSN1S2 casein-chitosan (B),CSN2-casein-chitosan (C) and CSN3-casein-chitosan (D)

2.7 不同质量浓度BCp12复合膜液及复合膜的抑菌效果

不同质量浓度的BCp12复合膜液及复合膜对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌效果如图8和表6、7所示。由表6和表7可知，BCp12质量浓度对金黄色葡萄球菌抑菌性影响较大，对大肠杆菌影响较小。随着BCp12质量浓度的增加，复合膜液及复合膜的抑菌圈逐渐增大。BCp12质量浓度为1.0 mg/mL的复合膜液及复合膜对金黄色葡萄球菌抑菌效果最好，且对2 种菌的抑菌性差异显著（P＜0.05）。当BCp12质量浓度为1.0 mg/mL时，复合膜液和复合膜对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径分别为（8.10f 0.06）mm和（7.21f 0.03）mm，且抑菌效果最好（P＜0.05），而大肠杆菌的抑菌圈直径分别为（7.05f 0.01）mm和（6.04f 0.06）mm。这与赵琼等[44]用MIC法研究BCp12对2 种致病菌的抑制效果基本一致。董晶等[45]研究抗菌肽-壳聚糖复合抗菌膜对金黄色葡萄球菌的抑菌效果优于大肠杆菌，与本实验结果一致。同一条件下，BCp12复合膜液和复合膜对2 种菌的抑菌效果不一致，结果表明复合膜液的抑菌效果更佳，可能是由于膜液中BCp12与酪蛋白、壳聚糖大分子之间具有较好的相容性。实际生产中乳扇的食源性致病菌中金黄色葡萄球菌较多，故选取1.0 mg/mL BCp12复合膜分析其对乳扇的保鲜作用。

表6 不同质量浓度的BCp12复合膜液对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌效果Table 6 Antimicrobial effect of composite film-forming solutions with different concentrations of BCp12 on Staphylococcus aureus and Escherichia coli

表7 不同质量浓度的BCp12复合膜对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌效果Table 7 Antimicrobial effect of composite films with different concentrations of BCp12 on Staphylococcus aureus and Escherichia coli

图8 各组复合膜液对金黄色葡萄球菌（A）和大肠杆菌（B）的抑菌效果Fig.8 Antimicrobial effect of composite film-forming solutions on Staphylococcus aureus (A) and Escherichia coli (B)

2.8 复合膜对乳扇的保鲜效果

2.8.1 感官评价

各组乳扇的感官得分在贮藏期内都有所下降，其中对照组的感官得分下降较快（图9）。这可能是4 ℃下不能完全抑制微生物生长，且微生物分解的速率足以使乳扇品质下降。1组、2组和3组贮藏60 d的感官得分差异较小，较贮藏初期明显下降，这是由于乳扇自身的乳酸菌生长代谢、蛋白和脂肪降解使乳扇的酸味、腐败味及酒味加重。根据Pinho等[46]对干酪风味的研究结果，干酪的风味强度随贮藏时间延长而增加。根据对Gouda干酪贮藏研究结果[47]推测蛋白质和脂肪的降解使乳扇微观结构中的孔隙增大和持水性下降，将导致乳扇质地变硬。同时，1、2、3组的保鲜效果更好，其可能是壳聚糖、酪蛋白、Nisin和BCp12复合膜可以抑制微生物的生长及蛋白和脂肪的分解，从而延长乳扇的货架期。

图9 乳扇贮藏期间的感官评价雷达图Fig.9 Sensory evaluation radar chart of milk fan during storage

2.8.2 过氧化值的变化

从图10 可知，对照组在第20 天时过氧化值为1.61 mmol/kg，BCp12组在第40天时过氧化值为1.68 mmol/kg，上升趋势比较缓慢。BCp12组在60 d内过氧化值变化不明显，说明BCp12起到较好的抗氧化作用。随着贮藏时间延长，乳扇中过氧化值逐渐增加，产生令人不悦的气味，其中对照组的过氧化值均高于实验组。这与苏科巧等[48]研究结果类似，与对照组相比，实验组乳扇氧化程度较慢，表明不同复合膜具有一定的抗氧化作用。

图10 乳扇贮藏期间过氧化值的变化Fig.10 Variation in peroxide value during storage of milk fan

2.8.3 色泽的变化

由图11可知，4 个处理组的L*值均随贮藏时间的延长呈下降趋势，这是由于脂肪被分解产生游离脂肪酸，蛋白质在酶和微生物的作用下产生氨基酸和小分子肽，与高鹏飞[49]的研究结果一致，由于这些油脂蛋白成分的变化会影响光的反射，从而使L*值不断降低。贮藏期间b*值逐渐升高，可能是由于蛋白质变得松软和坍塌，从而使松散的蛋白骨架无法包埋游离脂肪导致脂肪析出，这与田洋等[50]的研究结果一致，乳扇中的蛋白质和脂肪在微生物和内源酶的作用下发生降解，b*值增加。由此可知，BCp12能抑制乳扇中微生物生长并降低蛋白质水解及油脂析出，使乳扇保持一定的亮度和黄度。

图11 乳扇贮藏期间色差L*和b*值的变化Fig.11 Changes in color parameters during storage of milk fan

2.8.4 菌落总数的变化

如表8所示，对照组在前49 d内菌落总数上升，而后呈下降趋势，可能是乳扇中酵母菌或乳酸菌大量产酸使pH值下降，不耐酸的细菌大量死亡而造成的。1组、2组和3组都含有壳聚糖且具有抑菌活性，能通过阻止营养物质进入细菌体内或穿过细菌表面进入细胞内部，使细胞正常的代谢活动紊乱，从而抑制细菌生长。2组和3组乳扇贮藏期间菌落总数较1组和对照组少（P＜0.05），说明添加BCp12和Nisin能有效抑制微生物繁殖，从而达到较好的抑菌效果。

表8 乳扇贮藏过程中菌落总数的变化Table 8 Changes in total bacterial count in milk fan during storage

3 结论

本实验通过正交试验确定了复合膜的最佳工艺：酪蛋白/壳聚糖比例1∶1.5、甘油质量分数1.5%、干燥温度55 ℃；抑菌性方面，添加BCp12可显著提高其抑菌效果，当抗菌肽质量浓度为1.0 mg/mL时，复合膜液和复合膜的金黄色葡萄球菌抑菌圈直径分别为（8.10f 0.06）、（7.05f 0.01）mm，大肠杆菌抑菌圈直径分别为（7.21f 0.03）、（6.04f 0.06）mm，对金黄色葡萄球菌抑菌效果最佳；微观结构上，SEM和FT-IR结果表明复合膜有较好的相容性且未出现分层现象，分子对接结果表明BCp12的残基Y4与酪蛋白、壳聚糖之间存在较强的氢键作用，酪蛋白、壳聚糖、BCp12之间会引入更多亲水基团，使膜的保水性和持水性增加；将复合膜应用于乳扇保鲜，结果表明BCp12复合膜保鲜乳扇相较于对照组过氧化值变化较慢，说明BCp12膜的抗氧化效果较好，经4 ℃贮藏后保质期可达60 d，且复合膜对乳扇贮藏期间微生物的生长繁殖具有抑制作用。综上，将BCp12复合膜用于乳扇保鲜能延长乳扇保质期，这一研究结果可为复合膜用于乳扇保鲜技术的研究提供理论依据。