肿瘤标志物用于肺癌早期诊断的研究进展

樊 炜 马 玲 闫文慧 张汉东 徐秀花 燕 云

山西省大同市第二人民医院肿瘤医院 1 检验科 2 病理科 037000

肺癌是当前威胁人类健康最严重的疾病之一,患者的5年生存率低于20%,因此需要迫切找到肺癌早期筛查的诊断标志物以提高整体生存率。近年,肺癌早期诊断的新技术不断涌现,为肺癌的早发现创造了条件。本文对早期肺癌的诊断标志物研究进展进行了文献综述。

1 血清肿瘤标志物

血清肿瘤标志物指特征性存在于恶性肿瘤细胞,或由恶性肿瘤细胞异常产生的物质,或是宿主对肿瘤的刺激反应而产生的物质,并能反映肿瘤发生、发展,监测肿瘤对治疗反应的一类物质,存在于肿瘤患者的组织、体液和排泄物中,能用免疫学、生物学及化学的方法检测到。尽管从目前来看,传统的血清肿瘤标志物在诊断肺癌的敏感性和特异性较低,但一直作为肺癌筛查的辅助手段广泛的存在。

2 其他蛋白类肿瘤标志物

2.1 肿瘤相关自身抗体 肿瘤相关自身抗体的产生主要是由于肿瘤自身抗原通过过表达、突变、折叠错误、不适当降解、异常表达、翻译后修饰改变、异位表达引发机体免疫反应产生。尤其在癌症发生的早期,血清中自身抗体的表达量高,以及由于抗原—抗体反应的高特异性及敏感性,便于肿瘤的早期诊断。第20届世界肺癌大会(World Conference on Lung Cancer)[1]介绍了一项研究成果:肺癌自身抗体联合CT扫描能提高诊断率并降低肺癌病死率。临床目前应用于肺癌相关自身抗体的常见筛查组合为Sox2、PGP9.5、MAGE-A1、CAGE、GAGE7、GBU4-5、P537种抗原诱导机体免疫系统产生的抗体组合。Huang等[2]通过上述7种自身抗体评估诊断效果,发现7种自身抗体在肺鳞癌患者中具有更好的诊断价值,且7种自身抗体的组合较单一自身抗体在早期肺癌中的检测更可靠。

2.2 热休克蛋白 热休克蛋白(Heat shock proteins)是在细胞中广泛表达的分子伴侣的成员,在蛋白质折叠、蛋白质稳定性和维持细胞内稳态方面发挥着关键作用。Hsp90是一种进化上保守的分子伴侣,在各种应激相关蛋白中最常见,包括诱导型Hsp90α和组成型Hsp90β两个亚型。据报道,与正常健康对照组相比,肺癌患者血浆中Hsp90α水平较高,且表达水平与癌症的分型、分期相关[3-4]。

2.3 胸苷激酶 胸苷激酶(TK)催化脱氧胸苷在三磷酸腺苷(ATP)存在下转化为单磷酸胸苷(TMP),是细胞增殖的重要标志物。TK有两种同工酶:细胞质中的TK1依赖细胞周期,线粒体中的TK2不依赖细胞周期。TK1的浓度和活性在细胞周期的G1期晚期增加,在S期晚期/G2期早期达到峰值,在有丝分裂期水平趋于下降。TK1作为多种恶性肿瘤的“通用”标记物,在肺腺癌患者中过表达,从而促进肺腺癌细胞的生长及转移,TK1在肺腺癌细胞中的转录过度表达部分是由MAP激酶途径以转录因子MAZ依赖的方式驱动的[5]。TK1作为一种单一的诊断增殖性肿瘤生物标记物,并非疾病的重要指标,因此建议将其与其他肿瘤标记物结合使用。TK1联合CEA、CYFRA21-1和NSE对肺癌的诊断价值显著高于单独使用各生物标志物, 且TK1浓度与TNM分期显著相关[6]。

3 循环核酸

3.1 循环肿瘤DNA 循环肿瘤DNA(ctDNA)是指进入血液循环中坏死或凋亡的肿瘤细胞产生的DNA,随着肿瘤负荷的增加而升高,是一种特征性的肿瘤生物标记物。1977年Leon等[7]发现,肿瘤患者的血浆游离DNA水平要明显高于健康人群。1994年Sorenson等[8]从胰腺癌患者的血液中检测到KRAS基因突变,并且血液中检测到的突变与肿瘤组织中的突变相一致,证实血液中的突变基来源于肿瘤,由此发现了ctDNA可以作为一种新型的肿瘤标志物。近来研究发现,通过定性和定量分析ctDNA突变等信息,能够反映肿瘤的遗传改变以及肿瘤负荷,监测血液微小肿瘤病灶[9-10]。

3.2 DNA甲基化 DNA甲基化是表观遗传修饰机制之一,对基因表达具有重要影响。异常的甲基化会使DNA的转录过程发生异常,进而与肿瘤的发生有着密切的联系。因此,对DNA甲基化进行检测,可为早期肺癌的诊断提供重要帮助。目前研究表明,双基因或多基因甲基化联合检测比单基因甲基化检测具有更高的敏感性和特异性。2020年世界肺癌大会发表的一项肺癌早筛的研究结果[11]显示:基于血液的非侵入性ctDNA甲基化检测可以早期检测和鉴别肺癌,且具有很高的敏感性和特异性。研究者从癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)项目中挖掘了人类甲基化450K芯片的可用数据用于最初生物标志物的筛选,最终构建了10-甲基化标志物模型,它的总体敏感性为73%,特异性为90%,显示了基于血液检测的早期肺癌筛查的潜力,而且该研究也证实了对肺癌分型具有良好的准确性。

3.3 微核糖核酸 微核糖核酸(MicroRNA,miRNA) 是一组由内源基因编码的长度为20～24个核苷酸的非编码单链RNA分子。它是一种分布广泛的小调控RNA基因。目前,多种miRNA被证实可以作为肺癌诊断的潜在分子标记物。Li等[12]报道,血清miR-25在NSCLC患者中显著升高,且与NSCLC分期及淋巴结转移显著相关。Zhao等报道[13],血清miR-205-5p是一种新的、有价值的肺癌诊断生物标志物, 通过负性调节新靶点TP53INP1促进肺癌细胞增殖和转移,进而影响P21、RB1和细胞周期蛋白D1的表达。Yang等[14]报道,血清miR-146b、miR-205、miR-29c、miR-30b和miR-337在NSCLC患者中显著上调,且多个miRNAs联合检测的敏感度和特异度均高于单一miRNA检测,对早期肺癌的检测准确率更高。

3.4 长链非编码RNA 长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)是一类转录本长度超过200bp的核糖核酸,其长度在200～1 000 000bp不等,定位于细胞核内或细胞基质内,在真核细胞内被普遍转录,但不具有或很少具有蛋白编码功能。目前,多种lncRNA被证实可以作为肺癌诊断的潜在分子标记物。与其他基于血液的肿瘤标记物类似,lncRNA在肺癌诊断中的敏感性和特异性有待提高,现在多选用多个分子标记物联合检测,以提高诊断性能。例如,GAS5和SOX2OT作为2种lncRNA应用于NSCLC患者的诊断,GAS5在NSCLC患者表达下调,而SOX2OT表达显著上升,两者联合检测的敏感度和特异度均高于单个lncRNA检测,对早期肺癌的检测准确率更高[15]。

3.5 核酸适配体 指数富集配体系统进化技术(Systematic evolution of ligands by exponentail enrichment,SELEX),是指应用大容量的随机寡核苷酸库,并结合聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)体外扩增技术,经过几轮或数十轮的筛选而获得的核酸适配体。核酸适配体具有高亲和力、易修饰、低成本、易于合成和低免疫原性等优势,可以针对细胞、蛋白质、组织、生长因子进行癌症生物标志物的研究[16]。Vidic等[17]使用A549细胞作为阳性靶细胞,经7个SELEX周期后,进行流式细胞术分析和分选,从中选出了能与CD90阳性表达的A549细胞结合的适配子(CD90为已报道的干细胞样细胞标记物),该研究为检测有肿瘤干细胞样特征的循环肺癌细胞提供了一种新的技术手段。除了在上述细胞系中的应用外,该技术已运用于临床实际中,Zamay 等[18]将过度表达上皮细胞黏附分子(EpCAM)的原发性肺癌细胞作为靶点,利用抗体竞争性置换的方法,即高浓度的EpCAM特异性抗体替换与靶细胞结合的适配体,得到与靶细胞有良好亲和力的适配体,所得到的适配体已成功应用于肺癌患者外周血临床样本中循环肿瘤细胞的分离和检测。

4 循环肿瘤细胞

循环肿瘤细胞(Circulating tumor cell,CTC)最初是由澳大利亚籍的医生在1869年提出,是指原发肿瘤细胞或转移瘤细胞脱落后进入血液循环的肿瘤细胞,存在于肿瘤的各个时期。一项前瞻性研究[19],通过ISET过滤富集技术检测168名慢性阻塞性肺气肿患者血液中的CTCs,并对CTC阳性的患者(共5名)进行CT扫描并跟踪随访1～4年,结果发现,这5名CTC阳性的患者确定有肺结节,随后行手术切除、病理检查确诊为早期肺癌,提示CTC可以用作肺癌早期筛查的潜在生物标记物。由于CTC在血液中罕见,因此该项检测首先面临的问题就是CTC的富集分离。随着CTC分离技术的逐步优化成熟,CTC携带的信息可以从多个层面进行研究:CTC是否存在、CTC计数、形态和免疫细胞化学、基因组学、转录组学和蛋白质组学分析[20]。

5 肺癌遗传易感性

肺癌的发生与遗传因素存在一定的相关性,遗传多态性促成了肺癌易感的差异性。遗传多态性主要涉及基因单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism, SNP)造成的高频低外显突变和关键基因突变引起的低频高外显突变[21]。

SNP主要指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种,占所有已知多态性的90%以上。SNP在人类基因组中广泛存在,平均每300个碱基对中就有1个,估计其总数可达300万个甚至更多。SNP基因发生频率较高,但是对肺癌遗传易感风险的影响相对较小。如错配切除修复基因(Excision repair cross-complementing, ERCC)1/2是与肺癌遗传易感性有关的常见基因。有研究发现[22],ERCC1基因C8092A位点单核苷酸多态性(SNP)与肺癌遗传易感性有关,与CC基因型相比,CA基因型人群患肺癌的风险较低。

关键基因突变引起的低频高外显突变,其等位基因在群体中变异频率<1%,与家族遗传性肿瘤的发生密切相关。研究显示[23],肺癌中肿瘤抑制基因CDKN2A的 p.Arg112dup突变携带者预期相对危险度(Relative risk, RR)为15.6,其一级亲属RR 为9,二级亲属为2.8。可见,低频高外显基因突变对肺癌遗传易感性的影响远大于高频低外显基因变异。

基于对肺癌遗传易感性的深入研究,使得对于肺癌的筛查由已发生肺癌的早期监测提前到肺癌可能发生的预测,尤其对于家族性肺癌易感基因突变者,建议其直系亲属进行相关基因的监测,方便后续的干预,降低直系亲属的肺癌死亡风险。

6 展望

由于肺癌患者发现时多处于中晚期,尽管随着治疗方法的不断改进,但5年生存率仍较低。因此,如何早期发现肺癌,一直是肺癌研究的重中之重。肺癌从发生、发展到死亡是长期演变的过程,这为肺癌的早期发现提供了机会。科学家一直致力于肿瘤标记物的研究,从分子、蛋白、细胞等多水平拓展着肿瘤标志物的研究范围,但目前还未发现相关肿瘤标志物能独立完成早期肺癌的筛查,随着研究的不断深入与发展,还会出现更多的新的评价指标,通过多指标的联合检测,配合其他诊断技术仍然是早期肺癌筛查的重要研究手段。

进一步,科学家已经开始从个体、群体的遗传背景上发现肺癌的遗传易感基因,使得肺癌从发现向肺癌发生的可能性预测前进了一步,随着基因组技术的进步,全基因组关联研究(Genomewide association study, GWAS)的开展,更多的易感区域及易感位点将被发现,这将为肺癌的发生提供更全面、更精准的预测。