miR-223-3p在老年结肠癌组织和癌旁组织中的表达水平及其生物学功能作用机制

赵涓涓 刘敏 江忍 张军 张弘

(1鄂州市中心医院病理科，湖北 鄂州 436000；2鄂州市中心血站)

结肠癌为消化系统恶性肿瘤常见类型，其发病大多认为与原癌基因激活和抑癌基因失活有关〔1〕。微小核糖核酸(miRNA)为内源性非编码RNA，能够与信使RNA结合调控基因表达〔2〕。有研究表明，结肠癌细胞中存在miRNA异常表达〔3〕。miR-223-3p广泛存在于血小板、血浆及内皮细胞中，具有调控血管内皮细胞基因表达的作用〔4〕。miR-223-3p已被证实在多种恶性肿瘤中异常表达〔5〕。但目前对结肠癌组织及癌旁组织中miR-223-3p表达情况及其生物学功能作用机制研究尚少。本研究旨在探讨miR-223-3p在老年结肠癌组织及癌旁组织中的表达水平及其生物学功能作用机制。

1 材料与方法

1.1一般资料 选取2016年8月至2021年8月鄂州市中心医院收治的108例初诊为老年结肠癌患者。纳入标准：①经病理检查确诊为结肠癌者；②接受手术切除治疗者；③病案资料完整者。排除标准：①已接受过相关抗癌治疗者；②有放化疗史者；③合并其他恶性肿瘤疾病者。将经手术切除的结肠癌组织标本作为研究标本，癌旁组织标本(距结肠癌组织边缘至少5 cm)作为对照标本。研究对象中男53例，女55例，年龄64～85岁，平均(70.34±11.42)岁。患者签署知情同意书，本研究经我院伦理委员会批准。

1.2细胞来源 人结肠癌细胞(SW480)：购于上海一研生物科技有限公司，货号EY-X0739，来源于结直肠腺癌原发病灶。人结肠癌细胞(SW620)：购于上海一研生物科技有限公司，货号EY-X1067，来源于结直肠腺癌淋巴结转移灶。

1.3细胞培养及传代 取SW480及SW620细胞置于10%胎牛血清RPMI1640培养基(广州沛瑜生物制品有限公司，货号AAPR123)中，37℃、5%CO2条件下培养；显微镜观察细胞生长情况，当细胞汇合度达到80%及以上时加入0.25%胰酶消化细胞制成单细胞悬液；吸取单细胞悬液移至离心管中，置于离心仪上800 r/min离心5 min；弃去上清液，加入10%胎牛血清RPMI1640培养基重悬细胞移至培养瓶中培养；待细胞生长状态良好时用于后续试验。

1.4实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR) 按照总RNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司，货号DP419)说明书提取结肠癌组织、癌旁组织和生长状态良好的SW480、SW620细胞总RNA。取100 ng RNA按照cDNA第一链合成试剂盒(天根生化科技有限公司，货号KR104)说明书以总RNA为模板逆转录成互补的cDNA第一链。以miR-223-3p(目的基因)和U6(内参基因)为模板，设计引物序列进行RT-PCR①反应体系：12.5 μl 2倍UltraSYBR Mixture、0.5 μl下游引物、0.5 μl上游引物、2 μl cDNA模板、9.5 μl双蒸水；②反应条件：95℃预变性10 min，1个循环，95℃变性15 s，60℃退火延伸1 min，40个循环；③结果分析：利用RT-PCR仪(美国ABI公司生产，型号7000)测定目的基因与内参基因Ct值，以2-ΔΔCt计算目的基因相对含量。

1.5细胞转染 取SW480细胞加入10%胎牛血清RPMI-1640培养基调整浓度为1×105个/ml，接种于6孔板内，每孔含2 ml细胞悬液；37℃、5%CO2条件下培养24 h至细胞汇合度达到30%～50%；以灭菌无RNA酶水溶解miR-223-3p mimics干粉制成20 μmol/L溶液，将250 μl不含血清的OPTI-MEM培养基(美国Gibco公司，货号31985062)与100 pmol miR-223-3p mimics溶液混合，取细胞置于混合培养基中孵育5 min；加入500 μl lipofectamin2000转染试剂(美国Invitrogen公司，货号11668-027)室温孵育15 min，37℃、5%CO2条件下培养，6 h后更换新培养基(10%胎牛血清RPMI-1640培养基)，37℃、5%CO2条件下继续培养48 h。取SW620细胞同样方法将anti-miR-223-3p转染至细胞。收集细胞进行RT-PCR检测转染后miR-223-3p表达水平。

1.6细胞增殖实验 取转染后SW480及SW620细胞加入10%胎牛血清RPMI1640培养基调整浓度为1×104个/ml，接种于96孔板内，每孔含2 ml细胞悬液；37℃、5%CO2条件下培养24 h至细胞汇合度达到90%及以上；加入20 μl MTT溶液(0.5%，北京索莱宝生物科技有限公司，货号M1025)，孵育4 h；弃去上清液每孔加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)溶液，低速震荡10 min后利用酶标仪(美国赛默飞世尔公司生产，型号Multiskan FC)测定其在570 nm处的光密度(OD)值，重复实验3次取平均值。

1.7细胞划痕实验 6孔板底部用Marker笔均匀划横线并横穿过孔，每孔至少穿过5条线；取转染后SW480及SW620细胞加入10%胎牛血清RPMI1640培养基调整浓度为1×105个/ml，接种于6孔板内，每孔含2 ml细胞悬液；37℃、5%CO2条件下培养24 h至细胞汇合度达到90%及以上；第2天使用枪头垂直于板底部横线划痕，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次去除划下细胞；加入10%胎牛血清RPMI1640培养基，37℃、5%CO2条件下培养，分别于0 h和24 h利用倒置显微镜拍照记录细胞划痕距离，计算迁移率。

1.8细胞侵袭实验(Transwell) 冰箱中取出基质胶(Matrigel)置于Transwell小室底部膜上室；取转染后SW480及SW620细胞加入10%胎牛血清RPMI1640培养基调整浓度为1×106个/ml，将细胞接种于上室，下室中加入10%胎牛血清RPMI1640培养基，37℃、5%CO2条件下培养箱中培养30 h；取出小室用棉签除去上层细胞，PBS溶液冲洗3次；加入甲醇室温固定30 min，吸去液体室温风干；将小室置于24孔板中，每孔加入1 ml 0.5%结晶紫溶液，室温染色30 min，PBS溶液冲洗3次后室温风干；将细胞移至载玻片上用中性树胶封片，光学显微镜200倍下随机选取4个视野观察并记录穿过基底膜细胞数量，重复实验3次取平均值。

1.9细胞凋亡实验 取转染后SW480及SW620细胞加入10%胎牛血清RPMI1640培养基调整浓度为(2～5)×105个/ml，置于离心仪2 000 r/min离心5 min，弃去上清液；加入500 μl PBS溶液重悬细胞，分别加入5 μl膜联蛋白(Annexin)V-FITC溶液和碘化丙啶(PI)溶液，室温避光孵育5 min；利用流式细胞仪(美国Beckman公司生产，型号CytoFLEX)观察细胞凋亡情况，计算细胞凋亡率，重复实验3次取平均值。

1.10Western印迹试验 取转染后SW480及SW620细胞接种于6孔板中，24 h后加入0.3%胰酶消化细胞；PBS溶液冲洗2次，5 min/次；按照鼠抗人B细胞淋巴瘤(Bcl)-2单克隆抗体(上海研生生化试剂有限公司)、鼠抗人Bcl-2相关X蛋白(Bax)抗体试剂盒(上海研生生化试剂有限公司)和鼠抗人β-actin抗体试剂盒(上海研生生化试剂有限公司)说明书操作，利用化学发光凝胶成像系统观察细胞中Bcl-2和Bax蛋白表达。

1.11统计学分析 采用SPSS20.0软件进行t检验、χ2检验。

2 结 果

2.1结肠癌组织及癌旁组织中miR-223-3p表达水平比较 结肠癌组织中miR-223-3p表达水平(6.25±1.80)显著高于癌旁组织(1.04±0.05；t=30.068，P<0.001)。

2.2SW480及SW620细胞中miR-223-3p表达水平比较 SW620细胞中miR-223-3p表达水平(1.52±0.33)显著高于SW480细胞(1.06±0.04；t=14.381，P<0.001)。

2.3转染后SW480及SW620细胞中miR-223-3p表达水平比较 SW480细胞中，转染组miR-223-3p表达水平(1.82±0.32)显著高于未转染组(1.05±0.25；t=19.706，P<0.001)；SW620细胞中，转染组miR-223-3p表达水平(0.75±0.07)显著低于未转染组(1.08±0.11；t=26.303，P<0.001)。

2.4miR-223-3p对细胞增殖的影响 转染24、48、72 h后SW480细胞转染组细胞计数显著多于未转染组(P<0.05)；转染48 h和72 h后SW620细胞转染组细胞计数显著少于未转染组(P<0.05)。见图1。

2.5miR-223-3p对细胞运动能力的影响 转染24 h后SW480细胞转染组迁移率显著高于未转染组，SW620细胞转染组显著低于未转染组(P<0.05)。见图2，图3。

图1 miR-223-3p对细胞增殖的影响

图2 SW480细胞划痕实验(×200)

图3 SW620细胞划痕实验(×200)

2.6miR-223-3p对细胞侵袭能力的影响 转染48 h后SW480细胞转染组穿过基底膜细胞数量显著多于未转染组，SW620细胞转染组显著少于未转染组(P<0.05)。见图4。

2.7miR-223-3p对细胞凋亡的影响 转染48 h后SW480细胞转染组细胞凋亡率显著低于未转染组，SW620细胞转染组显著高于未转染组(P<0.05)。见图4。

图4 SW480、SW620细胞侵袭(结晶紫染色，×200)及凋亡实验

2.8miR-223-3p对细胞中Bcl-2及Bax蛋白表达的影响 SW480细胞转染组Bcl-2蛋白表达水平(2.12±0.33)显著高于未转染组(1.75±0.27)，Bax蛋白表达水平(1.63±0.25)显著低于未转染组(2.07±0.31；t=9.018、11.482，均P<0.001)；SW620细胞转染组Bcl-2蛋白表达水平(1.53±0.40)显著低于未转染组(2.02±0.43)，Bax蛋白表达水平(1.84±0.36)显著高于未转染组(1.42±0.33；t=8.671、8.938，均P<0.001)。见图5。

图5 miR-223-3p对SW480、SW620细胞中Bcl-2及Bax蛋白表达影响

3 讨 论

随着人们饮食习惯改变，结肠癌发病率已位居恶性肿瘤疾病第二位并呈逐年上升趋势〔6〕。结肠癌治疗一般以根治性手术为主，化疗及免疫等治疗为辅，但对于无法进行手术治疗的结肠癌患者，化疗及免疫等治疗为其主要治疗方式〔7〕。靶向治疗是继手术、放疗及化疗后新兴的肿瘤治疗手段，具有高度针对性和分子特异性〔8〕。目前常见的结肠癌靶向药物包括抗血管内皮生长因子(VEGF)和抗人表皮生长因子受体(EGFR)，随着研究深入靶向治疗已从分子水平逐渐走向基因治疗〔9〕。miRNA为近年肿瘤治疗研究热点，程钧〔10〕研究发现，miRNA的异常表达与结肠癌进展密切相关。miR-223-3p为造血系统调控因子，已证实可调控胃癌细胞周期和凋亡〔11〕。本研究结果提示，miR-223-3p可能参与结肠癌发生发展，发挥原癌基因作用。本研究结果提示miR-223-3p可能参与结肠癌细胞转移，可促进结肠癌细胞增殖，增加结肠癌细胞迁移、侵袭能力，并可抑制细胞凋亡。Bax蛋白具有BH1-3结构区域，为细胞凋亡促进因子。Bcl-2蛋白具有BH1-4保守结构区域，为细胞凋亡抑制因子。有研究表明，结肠癌HCT116细胞中Bax蛋白呈低表达，Bcl-2蛋白呈高表达〔12〕。本研究结果提示，miR-223-3p可通过促进Bcl-2蛋白表达抑制细胞凋亡参与结肠癌发生发展过程，同时miR-223-3p抑制剂可通过抑制Bcl-2蛋白表达和促进Bax蛋白表达促进细胞凋亡，miR-223-3p有可能成为治疗结肠癌的新靶点。

综上，miR-223-3p参与老年结肠癌发生发展，可通过促进Bcl-2蛋白表达抑制细胞凋亡，促进细胞增殖、迁移及侵袭能力发挥原癌基因作用。