基于HMGB1/Beclin-1信号通路探讨雷公藤多苷对肾病综合征模型大鼠保护机制

罗亚丹 袁立英 裘志成 何鸿

(遵义医科大学 1第三附属医院肾内科，贵州 遵义 563000;2第一附属医院肾内科;3遵义医药高等专科学校健康管理系)

肾病综合征(NS)是一种具有复杂发病机制的代谢综合征，表现为尿蛋白增加，高脂血症等〔1〕。目前，该病的临床治疗主要以激素干预为基础，但由于激素的不良反应和患者身体敏感性的差异，其效果有限〔2〕。 MicroRNA是小非蛋白质单链RNA，可通过组织中的转录调节靶基因的表达。研究表明，MicroRNA参与了一系列过程，包括细胞发育、细胞凋亡和自噬〔2，3〕。研究发现〔4〕，miR-141和HMGB1/Beclin-1之间的平衡是引起NS的重要原因。雷公藤多苷是一种具有强效的调节免疫作用与广泛性的消炎作用的生物大分子，它从雷公藤植物中提取〔3〕。本研究通过动物实验研究雷公藤多苷在治疗NS中的潜在应用价值及驱动这种效应产生可能的机制。

1 材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物 SPF级的成年Wistar大鼠60只，全部选用雄性，体重200～250 g,8周龄。实验用大鼠由北京维通利华动物实验技术有限公司提供，实验动物使用许可证号：SYXK(京)2014-0002。大鼠饲养于SPF级环境下，定时辐照灭菌，实验全程给予所有大鼠便捷自由的饮水和采食设备，随时观察大鼠状态，排除饲养过程中产生的系统误差。适应性喂养1 w后，开始实验建模。

1.1.2实验用药 雷公藤多苷片，每片10 mg，使用时研磨成细粉。批准文号：国药Z43020138，湖南千金谢利制药有限公司生产。

1.1.3实验试剂 注射用盐酸阿霉素，购自深圳万乐药业有限公司，产品批号为：国药准字H44024359。醋酸泼尼松龙片，购自上海上药信谊药厂有限公司，产品批号为：国药准字H31020771。兔抗大鼠 LC3 购自北京索莱宝科技有限公司，产品批号为：3950。肿瘤坏死因子(TNF)-α酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(批号：E201609)、兔抗大鼠 HMGB1 抗体(批号：11570-1-AP) 、山羊抗大鼠 Beclin-1抗体(批号：9144-3-CB)、白细胞介素(IL)-4 ELISA试剂盒(批号：P201912)和IL-8 ELISA试剂盒(批号：P201905 ) 均由北京森和优生物有限公司生产。

1.2实验方法

1.2.1分组和建模 60只大鼠随机分为6个实验组。除空白对照组外其余组所有大鼠尾静脉注射盐酸阿霉素5 mg/kg，建立NS模型〔5〕。大鼠24 h尿蛋白显著增加，说明模型成功建立〔6〕。空白对照组的大鼠注射等体积生理盐水。

1.2.2药物处理 模型建立5 d后开始进行药物处理。低、中、高剂量组分别给予3、6、12 g/kg雷公藤多苷灌胃处理；阳性对照组给予醋酸泼尼松0.2 g/kg灌胃处理；模型对照组和空白对照组每日给予等体积的蒸馏水。共持续14 d，并且药物处理组固定时间给药，空白对照组于相同时刻灌胃蒸馏水。

1.2.3检测方法

1.2.3.1大鼠一般状态 给药期间，观察大鼠毛发、进食量、精神、大便、体重情况等。

1.2.3.2苏木素-伊红(HE)染色组织学观察 给药结束后24 h观察组织，7.5 ml/kg氨基甲酸乙酯麻醉大鼠并处死。从腹部取出肾脏组织，并分两部分保存，其中一份-80℃冰箱保存，另一份10%多聚甲醛常温保存。将固定好的肾脏组织包被在石蜡中，切片，进行HE染色。首先，应将固定好的切片放至显微镜下，调整视距使镜内的细胞细节清晰，然后观察切片组织发生的细胞病理学变化。病理学变化的程度以肾脏组织的病理学评分为标准，分别为：0分：无充血、水肿、炎症浸润等现象的正常组织；1分：血管轻度水肿且组织界限模糊，表现为皮质及髓质模糊，并出现炎性浸润；2分：组织明显充血水肿，肾皮质与髓质之间的界限消失，细胞的炎性浸润显著；3分：肾组织各结构模糊不清，显著受损，血管模糊，细胞出现严重的炎性浸润。

1.2.3.3TUNEL法肾组织凋亡观察 取出-80℃放置的肾组织冷冻切片，加入50 μl蛋白酶K，37℃孵育20 min，加入TUNEL反应液，37℃孵育1 h，使用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗两次切片，添加过氧化物酶结合抗体，37℃孵育1 h，孵育结束后，使用二氨基联苯胺(DAB)染色，然后用苏木素复染。脱水封片，并在显微镜下观察细胞凋亡情况。凋亡细胞核染色呈棕色。用ImageJ软件定量分析细胞凋亡率，细胞凋亡率(%)=棕色细胞数/细胞总数 × 100%。

1.2.3.4外周血细胞TNF-α、IL-4、IL-8含量的测定 处死大鼠后，收集10 ml血液，并以3 000 r/min进行离心，放置在15 ml离心管中离心10 min，取上层分离的血清液采用ELISA检测血清中TNF-α，IL-4和IL-8的水平。

1.2.3.5ELISA测定HMGB1、LC3与Beclin-1的蛋白表达水平 将肾脏组织添加到IPA裂解缓冲液中，并放置于冰上，低温裂解20 min。BCA法处理样本，使用96孔分别添加，对样本进行总蛋白浓度定量，确定后续加样量，以进行Western印迹实验。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离转膜质量相等的蛋白质条带，添加一抗与β-actin内参(1∶500)然后在4℃摇床孵育过夜。 过夜后，先检查膜上是否有没浸润的地方，若浸润充分则使用TBST进行洗涤，洗涤3次，每次同样在摇床放置5 min，提高洗涤效率。洗涤后，添加二抗(1∶500)，使用电化学发光(ECL)试剂曝光显色，并使用QuantityOne软件分析相对蛋白质表达水平。

1.3统计学方法 采用SPSS23.0统计软件进行t检验。

2 结 果

2.1大鼠一般状态比较 空白对照组精神状态良好，反应灵敏，毛发光滑发亮，进食正常。模型对照组造模后第7天，大鼠尿量减少并伴有少量的腹水现象，精神状态日渐萎靡，进食减少，体重下降；造模后第7～14天，大鼠腹水显著增多，出现嗜睡、反应迟钝，有弓背耸肩现象，蜷卧少动，体毛发灰发暗，大便稀溏等体征；与模型对照组相比，低、中、高剂量组在5 d给药后，大鼠的活跃度较高，精神好转，毛发渐有光泽。

2.2各组肾组织HE染色 空白对照组肾脏大小正常且组织细胞边界清晰，无炎症，浸润未出现充血。模型对照组肾脏肿大，肾皮质与肾髓质出现分界模糊，血管充血症状，炎症和浸润明显。低、中、高剂量组上述症状程度较模型对照组轻。

与空白对照组相比，模型对照组肾组织病理评分较高，且差异显著(P<0.05)；与模型对照组相比，药物处理各组的肾组织病理评分均较低，且差异显著(P<0.05)。雷公藤多苷的治疗效果具有显著剂量依赖性(P<0.01)。见图1、表1。

图1 各组肾组织形态(HE染色，×200)

2.3各组肾组织凋亡比较 与空白对照组相比，模型对照组与药物处理各组的凋亡细胞数量增加，且差异显著(P<0.05)；与模型对照组相比，药物处理各组肾脏中凋亡细胞数量降低，且差异显著(P<0.05)。雷公藤多苷治疗效果具有显著剂量依赖性(P<0.01)。见表1，图2。

2.4各组肾组织TNF-α，IL-4，IL-8含量比较 与空白对照组相比，模型对照组及药物处理各组TNF-α、IL-4、IL-8含量增加，且差异显著(P<0.05)；与模型对照组相比，药物处理各组肾脏中TNF-α、IL-4和IL-8的含量降低，且差异显著(P<0.05)。雷公藤多苷的治疗效果具有显著剂量依赖性(P<0.01)。见表1。

表1 各组肾组织病理评分、凋亡及TNF-α、IL-4、IL-8表达比较

2.5各组肾组织中HMGB1/Beclin-1信号通路的蛋白表达对比 与空白对照组相比，模型对照组及药物处理各组HMGB1、LC3、Beclin-1蛋白表达出现增加，且差异显著(P<0.05)；与模型对照组比较，药物处理各组中HMGB1/Beclin-1信号蛋白的表达量均降低，且差异显著(P<0.05)，与低剂量组相比，高、中剂量组HMGB1/Beclin-1信号蛋白的表达均降低，且差异显著(P<0.01)。见图3、表2。

图2 各组肾组织凋亡影响的比较(TUNEL染色，×200)

1～6：模型对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、阳性对照组、空白对照组

表2 HMGB1/Beclin-1信号通路蛋白表达比较

3 讨 论

研究发现〔7，8〕，NS具有复杂的发病机制，可能机制与炎症反应，微循环阻碍及机体代谢异常有关。在中医中，NS属于“水”和“缺乏”两类。其发病原因，可能主要是由肺、脾和肾的功能障碍导致，其实质是肾虚。处理原则应为除风促水。要移动脾虚消湿，促进血液循环消瘀，促进排湿热，解湿热毒等〔9〕。雷公藤多苷是一种植物提取的生物大分子，具有调节免疫作用与消炎作用〔3〕，有“中草药激素” 之称，其为我国首先研究利用的一种具有消炎免疫作用的中草药。自噬是一种程序化的生存模式，通过自噬相关因子调节自噬囊泡的降解，以维持内部环境的稳定性和细胞代谢的平衡〔10〕。研究表明miR-141可以与HMGB1启动子结合以靶向并抑制HMGB1的表达，从而阻断HMGB1/Beclin-1途径，减弱由急性肾损伤(AKI)诱导的NS〔11〕。生理自噬不能触发NS的病理过程。当人体中发生了炎症反应时，人体外周血内白细胞的比例类型将发生变化。在免疫机制下，人体白细胞会发生过多变化〔12〕。

有研究指出，TNF-α、IL-4和IL-8可以通过调节多种细胞信号通路来增强炎症反应〔13〕。雷公藤多苷对NS有较好的改善和治疗作用，但具体作用机理尚不清楚。本文结果表明，雷公藤多苷可能通过调节NS大鼠的免疫变化，发挥了抗炎作用。

HMGB1可以在染色质的结构中发挥重要作用，影响核中的转录与复制、重组的效率及基因组的整体稳定性，还可以用作胞外信号分子，来进行炎症，免疫反应，自噬和癌症的微观调节〔14〕。Beclin-1是第一个被证实的自噬基因，在炎症中起重要作用〔15〕。 有研究表明，细胞质HMGB1可将Beclin-1分子从其抑制伴侣Beclin-2分子中分离出来，并通过Beclin-2分子促进Beclin-1分子和Ⅲ型磷酸肌醇3激酶的结合，来激活自噬〔16〕。有证据〔17〕表明，miR-141可以与HMGB1mRNA启动子上的HMGB1受体结合来阻断其表达，从而抑制HMGB1/Beclin-1途径来阻断刺激自噬体的过程。NS发作期间上述指标是否有变化尚未得到证实〔18〕。本研究表明，HMGB1/Beclin-1信号通路的传导信号增强。这也证实了HMGB1/Beclin-1信号通路及其调控机制与NS的发病机制有关〔19〕。本实验表明，雷公藤多苷可有效降低肾脏组织中HMGB1、LC3和Beclin在NS模型大鼠的表达，并通过降低蛋白表达的方式调整了HMGB1/Beclin-1的信号通路HMGB1、LC3、Beclin-1的负反馈机制，从而有效地控制了信号通路的传导并控制了疾病的进程。

因为雷公藤多苷对蛋白尿的短期作用相对明显，没有激素治疗导致脸圆、身胖的不良反应，由于原产地国内，且前期研究国内较为深入，作为国内的平价药物具有价格不贵，服用方便的优点。但有研究表明，其可能对女性肾病患者具有一定的毒害作用〔20〕。后续研究中，应进行对应方面研究的拓展。

综上所述，雷公藤多苷可通过调节HMGB1/Beclin-1通路，降低蛋白表达的方式，降低肾细胞凋亡，控制细胞内负反馈调节机制，从而影响NS大鼠的病程。表明miR-141可能是NS治疗的潜在靶标。下一步可以从分子和遗传学的角度，继续深入探讨雷公藤多苷对NS的治疗作用。