线粒体自噬在糖尿病肾病中作用机制的研究进展

于光辉综述,郭兆安审校

0 引 言

肾耗氧及耗能高,由线粒体生成的三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)参与管球反馈,影响肾血流与氧气的运输。作为细胞的内在动力,线粒体是调节细胞存活与死亡(凋亡、自噬、坏死)的关键,增强线粒体自噬可调节免疫细胞的功能,改善炎症,延长寿命,但线粒体自噬不足与过度都会促使细胞损伤和死亡［1-2］。糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是终末期肾病最常见的病因,主要病理是肾小球微血管损伤、足细胞丢失、肾小管与间质病变,与氧化应激、炎症反应等过程联系紧密。轻度氧化应激可以通过提高线粒体自噬水平、消除受损线粒体来维持肾细胞活力,过度则会促进纤维化发生。在高糖作用下,线粒体呼吸链向细胞质释放过量活性氧以传递缺氧信号,诱导线粒体去极化,降低呼吸链的活性并抑制线粒体自噬,导致肾对代谢性酸中毒的适应性下降,在多种炎症因子与促凋亡因子的刺激下细胞凋亡,严重的ATP耗竭后发生细胞坏死［3-5］。因此,通过改善肾细胞的线粒体自噬,进而减少炎症反应与氧化应激可能是治疗DN的新方法。

1 线粒体自噬概述

线粒体自噬是指细胞通过自噬调控机制选择性清除衰老及受损的线粒体的过程,具有防止有害物质积累、维持细胞稳态等作用。线粒体自噬可以通过裂变来调节,在饥饿和氧化等刺激下,动力蛋白1(dynamic-related protein 1, Drp1)激活后募集并剪切线粒体外膜,从而分离出受损线粒体以供自噬［6］。自噬受体与其靶标上的分子结合后,在含微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3, LC3)与LC3相互作用区(LC3-interacting regions, LIR)的作用下被引至自噬溶酶体,降解线粒体内容物从而提供能量以求存活［7］。然而,当线粒体频繁碎裂或长期受损时,线粒体自噬紊乱,可与细胞凋亡、坏死协同作用,导致ATP和蛋白质的合成受阻,膜的通透性改变甚至破裂,最终细胞死亡［8］。因此线粒体自噬具有促生存和促死亡的双重功能。

2 哺乳动物中线粒体自噬的调控机制

许多蛋白具有LIR或泛素结合区,通过参与自噬体之中靶细胞器或蛋白的包封,并融合溶酶体,从而促进线粒体自噬。作为线粒体自噬调节因子的假定激酶蛋白1(PTEN induced putative kinase 1, PINK1)、帕金森病蛋白(parkinson protein, Parkin)、Nip3样蛋白X(Nip3-like protein X, Nix)、腺病毒E1B相互作用蛋白3(adenovirus E1B 19 ku interacting protein 3, BNIP3)等因子的表达在糖尿病前期患者中显著升高。

2.1PINK1/Parkin介导的线粒体自噬PINK1/Parkin途径是控制线粒体质量的关键。当细胞受损时膜电位丧失,PINK1在去极化的线粒体表面积累后,以线粒体外膜基础泛素为底物来初始化通路,激活并募集Parkin后,将泛素链结合到线粒体外膜上,此过程为PINK1提供了更多泛素以磷酸化,导致Parkin进一步募集并迅速易位至受损的线粒体。此后,在LC3与LIR的作用下线粒体自噬被触发［9-10］。PINK1对线粒体功能障碍的快速反应、Parkin的快速激活和易位保障了线粒体自噬的有效开展。在PINK1/Parkin途径中,视神经蛋白(optineurin, OPTN)在泛素化运载物附近放大信号环路,保障靶向自噬膜或者其泛素转运体的进行［11］。

2.2Nix/BNIP3途径介导的线粒体自噬Nix以及其同源物BNIP3定位于线粒体,共享LIR序列,可锚定于线粒体外膜,与LC3B结合后触发线粒体去极化从而诱导自噬［12］。Nix蛋白磷酸化后将线粒体引入自噬体或增强Parkin的募集以启动线粒体自噬,然而Nix的表达随Parkin沉默而受抑［13］。Vincent等［14］发现,在炎症过程中,小鼠上皮细胞中线粒体分裂与Nix介导的自噬均上调,而在Nix敲除鼠中则存在异常线粒体的积聚。BNIP3具有促进线粒体裂变,抑制融合的作用。缺氧诱导的BNIP3过表达可抑制活性氧的产生,增加自噬性死亡,从而保护机体免于细胞坏死［15-16］。因此,Nix与BNIP3是潜在的靶蛋白,可通过调控线粒体自噬从而在早期干预肾功能恶化与细胞死亡。

2.3FUN14结构域包含蛋白1(FUN14 domain-containing 1, FUNDC1)/酪氨酸激酶(steroid receptor coactivator, SRC)途径介导的线粒体自噬内源性FUNDC1位于线粒体外膜,在缺氧时发挥促进线粒体自噬的功能,其介导的线粒体自噬依赖LIR与LC3之间的相互作用从而为细胞存活提供优势［17］。正常情况下,位于LIR基序中的酪氨酸18经SRC诱导后磷酸化,导致FUNDC1 LIR对LC3产生空间位阻,抑制线粒体自噬的发生。而缺氧会抑制SRC活化,并诱导LIR去磷酸化后增强对LC3的亲和力进而促进自噬［18］。因此,FUNDC1 LIR的可逆磷酸化可作为线粒体自噬分子的开关,SRC充当线粒体自噬的负调节剂。此外,FUNDC1/SRC线粒体自噬轴还参与细胞侵袭与迁移、血管生成等多种过程,并与糖尿病、癌症、肾纤维化等密切相关［19］。

2.4硫氧还蛋白互作蛋白(thioredoxin-interacting protein, Txnip)途径介导的线粒体自噬Txnip是一种由高血糖诱导的促炎因子,定位于细胞核,具有抗增殖作用［20］。Txnip的激活是糖尿病迈向DN的关键一步,在高糖环境中,Txnip在活性氧的调节下转移至线粒体,抑制LC3形成从而影响自噬,并促进细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的沉积,导致肾小球硬化与肾间质纤维化;而抑制Txnip后,活性氧产生减少,氧化应激、炎症反应减轻,线粒体自噬恢复［21］。Txnip还可干预哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)从而调控细胞增殖、凋亡等过程。虽然Txnip在DN进展中的作用并未超过代谢和血流动力学改变而产生的影响,但是肾靶向抑制Txnip可能是辅助治疗DN的一种新型策略。

2.5双特异性蛋白磷酸酶1(dual-specicity protein phosphatase 1, DUSP1)介导的线粒体自噬DUSP1具有苏氨酸和酪氨酸双重特异性,可稳定膜电位,限制细胞色素C释放,抑制半胱氨酸蛋白酶等凋亡因子的表达,维持线粒体稳态。在缺血再灌注损伤后,DUSP1的表达下调而Drp1、LC3、Bnip3随之激活,出现线粒体分裂与自噬过度,导致线粒体代谢紊乱、ATP短缺与细胞坏死;重新引入DUSP1即可减弱Drp1与Bnip3的表达,改善呼吸参数,维持能量平衡从而逆转细胞活力［22］。Lu等［23］的试验发现,DUSP1过表达可促进Parkin表达,减少活性氧的产生并改善线粒体功能。总之,DUSP1通过参与线粒体裂变,调节Parkin、Bnip3介导的线粒体自噬从而在损伤中发挥防御作用。

3 线粒体自噬与DN

线粒体是所有细胞的动力,还可诱导线粒体生物发生以调控能量平衡［24］。肾细胞中线粒体含量丰富,近端小管细胞的线粒体含量最高,线粒体氧化磷酸化产生的ATP为各种物质的重吸收提供了足够的动力,而足细胞、内皮细胞和系膜细胞则主要依赖糖酵解供能。Coughla等［25］的试验指出,DN中线粒体功能受损早于蛋白尿和肾组织学变化出现。在糖尿病早期,肾激活线粒体自噬以求清除受损线粒体。随着DN的进展,Drp1持续激活,线粒体裂变增加但融合与自噬受阻,线粒体外膜破裂,受损线粒体碎片积累并加剧了ATP缺乏;持续高糖环境致使电子的产生增加,多余的电子被传递至氧气,形成活性氧的前体O2-,导致线粒体活性氧生成增加,当活性氧的产生超过了抗氧化机制的中和,就会导致内皮损伤、足细胞骨架的重组、系膜扩张,滤过屏障被破坏导致蛋白尿的出现;细胞膜电位持续降低,反而提供自噬信号,引起线粒体自噬紊乱,加速DN进程［26-28］。因此,线粒体自噬是DN发病的关键媒介。

3.1足细胞与线粒体自噬足细胞需要大量能量来合成细胞骨架与ECM以支持肾小球毛细血管,因此对线粒体功能极其敏感。持续性高糖环境会触发线粒体损伤与碎片化,抑制自噬溶酶体的形成,并加速氧化应激与足细胞损伤、凋亡。高血糖使Drp1活性增加并向线粒体募集,在丝氨酸600位点磷酸化后启动线粒体分裂,线粒体的平均大小和周长显著减少,而活性氧生成增多使线粒体功能紊乱,足细胞氧化呼吸显著受限,肌动蛋白细胞骨架发生重塑;PINK1与LC3的共定位减少,线粒体自噬受阻,出现足细胞凋亡,下调Parkin后足细胞凋亡进一步增强［29-31］。Zheng等［32］的试验发现,高糖可以增加糖尿病小鼠足细胞中SRC的磷酸化水平,抑制FUNDC1介导的线粒体自噬;使用SRC抑制剂干预有助于逆转自噬通量并恢复膜电位,阻抑足细胞凋亡,从而降低血肌酐、尿白蛋白水平,而在FUNDC1耗尽后SRC抑制剂却无法保护足细胞。TXNIP与氧化应激、上皮间充质转化的调节以及足细胞表型有关,敲除TXNIP可通过抑制mTOR活化从而减轻高糖诱导的足细胞nephrin、synaptopodin等表型改变和活性氧生成,破坏上皮间充质转化,保护糖尿病小鼠免受足细胞耗竭［33］。此外,PINK1介导的线粒体自噬与足细胞中胰岛素信号传导有关,在高糖处理的足细胞中PINK1表达下调,导致白蛋白的通透性显著增加,足细胞对葡萄糖的摄取受限,使得胰岛素信号通路失调［34］。以上研究表明PINK1/Parkin、FUNDC1/SRC、TXNIP介导的线粒体自噬是足细胞防御机制,旨在减轻氧化应激,恢复膜电位,以及维持胰岛素信号传导和足细胞的适当通透性。

3.2系膜细胞与线粒体自噬系膜细胞约占肾小球细胞的三分之一,在肾小球毛细血管袢之间构成支撑框架,并通过改变血管形状而影响肾血流［35］。高血糖会诱发系膜细胞分泌过量胶原蛋白和纤连蛋白促使ECM大量积聚,随后系膜扩张、丧失活力并阻塞毛细血管,导致系膜纤维化发生,线粒体自噬与上述过程密切相关［36］。系膜细胞中Drp1在高糖诱导的6 h内上调并异位至线粒体维持36 h,生成的过多活性氧促进了ECM的产生［37］。Wei等［38］指出,高糖培养的系膜细胞LC3阳性表达率降低,而活性氧、纤连蛋白的生成与mTOR的活化增加,促进白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α等炎性因子转录,引起线粒体自噬受阻,发生系膜增殖与纤维化。Chen等［39］的试验发现,高糖处理的小鼠系膜细胞中SRC磷酸化的时间增加并伴随胶原蛋白IV积聚,使用SRC抑制剂即可阻断胶原蛋白IV合成,开启FUNDC1介导的线粒体自噬并预防DN与纤维化。尽管目前研究较少,但靶向线粒体自噬的抗系膜纤维化作用,深入研究SRC、mTOR等相关通路有望出现延缓DN进展的新思路。

3.3内皮细胞与线粒体自噬肾小球内皮细胞依靠独特的窗孔特征以及糖萼蛋白发挥滤过功能,与足细胞损伤相比,内皮细胞功能障碍和糖萼损伤与蛋白尿的关系更密切。糖尿病患者存在广泛的内皮窗孔与糖萼减少,持续的高血糖环境使一氧化氮的产生受阻,诱导内皮细胞氧化应激增强,促进血管炎症与动脉硬化,微量白蛋白尿导致内皮进一步受损,出现多种大血管和微血管并发症［40］。内皮细胞能量需求相对较低,其线粒体主要发挥对环境信号的响应的作用。线粒体自噬是内皮细胞的适应性反应,促进自噬可改善血管功能,延缓内皮细胞衰老,而自噬基因缺陷会导致毛细血管稀薄［41］。在高糖培养下,内皮细胞Drp1、PINK和Parkin表达降低,靶向照射内皮细胞线粒体诱导的氧化损伤可促进Parkin向去极化线粒体转移,使LC3-II的形成增加,膜电位升高,从而延长内皮细胞的寿命［42-43］。现代研究发现,肾小球存在足细胞-内皮细胞串扰,内皮细胞线粒体自噬缺陷会导致窗孔结构缺失和足细胞耗竭［44］。内皮细胞损伤是造成足细胞凋亡和肾小球硬化的必要条件,反过来足细胞凋亡也会导致内皮细胞线粒体自噬失调和氧化应激［45］。线粒体自噬可以保护肾小球内皮细胞抵抗高糖造成的损伤,并在肾小球细胞间串扰间发挥重要作用,未来侧重探索线粒体自噬、氧化应激在延缓内皮衰老及参与足细胞-内皮细胞串扰等方面可能有助于DN的治疗。

3.4小管细胞与线粒体自噬小管细胞占皮质的90%,对离子的重吸收依赖线粒体主动转运。DN研究的焦点已渐渐由肾小球病变转移至肾小管损伤,包括肾小管炎症、萎缩与间质纤维化。在DN早期,高糖改变了血流动力学,使近端小管过度重吸收,输送至致密斑和远端肾单位的钠减少,管球反馈下调,近端小管缺氧导致线粒体断裂和ATP生成降低,最终小管坍塌萎缩。暴露在高糖环境48 h之内的近端小管细胞即出现膜电位丧失、线粒体肿胀碎裂与线粒体活性氧增加,PINK1/Parkin通路受抑［46］。随着DN进程,肾小管损伤的加剧,肾DUSP1、Nix表达随之降低,自噬体的形成显著受阻,受损线粒体聚集导致肾小管上皮细胞的早衰和肾功能障碍;而过表达DUSP1与Nix即可恢复自噬通量,改善线粒体自噬功能,并减少活性氧的产生与小管细胞凋亡［47-48］。DN晚期,肾小管间质、肾小球的损伤形成纤维化,线粒体自噬与纤维化过程中细胞凋亡、炎性细胞浸润和氧化应激等机制的失衡有关。高糖导致肾小管细胞线粒体嵴破坏严重,自噬清除减少而氧化应激过度,表现为LC3、BNIP3、线粒体活性氧的增加与ATP产生率下降,而抑制LC3的表达并逆转高糖对ATP生成率的抑制后,肾间质胶原与ECM的生成也随之减少［49-50］。Txnip敲低可以抑制BNIP3过表达导致的自噬性死亡,改善小管细胞中高糖诱导的上皮间充质转分化,抑制白细胞介素-1β与半胱氨酸蛋白酶-1等炎性因子的转录从而延缓小管间质纤维化［51］。Chen等［52］的研究发现,DN患者OPTN水平与白细胞介素-1β/18、核苷酸结合域样受体蛋白3等炎性因子呈负相关,OPTN通过结合泛素化底物并通过LIR将其转运到自噬体,促进PINK1/Parkin介导的线粒体自噬,抑制炎性小体的激活从而减轻小管间质炎症。肾小管病变在DN的病理过程中逐渐得到重视,线粒体损伤出现时间早,靶向PINK1/Parkin、DUSP1、Nix/ BNIP3、TXNIP等线粒体自噬相关通路可能是预防和治疗DN肾小管病变的一种新的治疗策略。

4 总 结

由于肾固有细胞对线粒体的依赖,线粒体在DN中处于关键地位。线粒体自噬在缓解炎症反应与细胞衰老、维持滤过屏障的完整、抑制肾纤维化等方面潜力无穷。了解DN中线粒体自噬的病理生物学,选择性调节线粒体自噬因子,包括OPTN、Txnip、SRC和DUSP1等,将有助于新治疗方案的开发。然而针对自噬机制的研究仍处于单一阶段且多为动物研究,信号通路之间的相互作用仍是未知,DN的线粒体自噬的药理学研究仍处于初级阶段,临床上也缺乏易于检测自噬的标志物与靶向自噬的药物,如何正确利用这把“双刃剑”将成为医学工作者的新挑战。