CAR-T联合免疫检查点抑制剂或白细胞介素在恶性肿瘤中的研究进展

刘佳静,王文艺综述,顾 军审校

0 引 言

嵌合抗原受体T细胞治疗(chimeric antigen receptor T-Cell immunotherapy, CAR-T)是一项极具前景的恶性肿瘤免疫治疗技术。CAR-T细胞通过细胞外结构域识别细胞表面蛋白使 CAR-T 细胞能够靶向癌细胞进行细胞毒性杀伤。CAR-T技术自问世以来也逐渐被完善和更新换代,目前已发展到第五代,其增殖能力和杀伤能力均得到明显增强。在安全性方面,CAR-T的主要不良反应是细胞因子释放综合征(cytokine release syndrome, CRS)和免疫效应细胞相关神经毒性综合征(immune effector cell-associated neurotoxicity syndrome, ICANS),目前控制其不良反应的主要措施是使用糖皮质激素等全身免疫抑制剂。目前CAR-T疗法在血液恶性肿瘤的治疗中取得了显著的成功,但对实体肿瘤的疗效欠佳。可能的原因包括实体瘤特有的肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME),肿瘤细胞在微环境中招募大量的免疫抑制性细胞,如肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophage, TAM)、肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblast, CAF)、髓源性抑制细胞(myeloid-derivedsuppressor cell, MDSC)和调节性T细胞(regulatory T-cell, Treg),促进免疫抑制细胞因子和可溶性因子的产生,CAR-T向实体瘤TME内的有限转运以及TME内多种免疫抑制性信号均限制了CAR-T细胞的功效。而且实体肿瘤存在肿瘤内部克隆异质性,由于癌细胞的亚克隆分化,实体瘤的肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen, TAA)和肿瘤特异性抗原(tumor specific antigen, TSA)可能表现出广泛的表达谱,这就需要CAR-T细胞靶向多种肿瘤抗原,才可达到有效治疗。现阶段提出的克服实体瘤对CAR-T治疗的抗性的主要策略是将CAR-T治疗和其他抗肿瘤疗法联合使用,如放疗、化疗、免疫检查点抑制剂、癌症疫苗、细胞因子治疗、溶瘤病毒治疗、CRISPR/Cas9基因编辑技术等［1］。其中CAR-T细胞治疗与免疫检查点抑制剂的组合以及CAR-T细胞治疗与白细胞介素的组合是很有潜力的临床治疗策略。

1 CAR-T联合免疫检查点抑制剂

肿瘤细胞表面的PD-1受体和T细胞表面的PD-L1配体相互结合可以导致T细胞杀伤肿瘤细胞的功能受到抑制,这一现象也叫T细胞衰竭。除PD-1,肿瘤细胞表面还存在一些蛋白如LAG3、CD160、TIM3和CTLA4等也可以与T细胞表面的相应配体相互作用,削弱T细胞的功能和增殖活性。因此使用免疫检查点抑制剂可以显著增强细胞毒性T细胞的杀伤肿瘤活性。实体瘤具有免疫抑制性TME,其致密的肿瘤基质网络和扭曲的未成熟血管均不利于CAR-T细胞向TME的转运,而且CAR-T细胞在TME中的功能和持久性也有限,肿瘤抗原对CAR-T细胞的慢性刺激导致CAR-T细胞功能衰竭,如肿瘤细胞表面的PD-L1和PD-L2的过表达直接抑制CAR-T细胞的效应功能。因此目前增强CAR-T对实体瘤的疗效的策略之一是将CAR-T治疗和免疫检查点抑制剂结合,来增强TME中T细胞的功能,提高其持久性。组合的策略包括细胞外和细胞内两种。

1.1细胞外策略有研究显示,将靶向HER-2的CAR-T细胞与乳腺癌细胞共培养,CAR-T细胞表面的PD-1表达呈上调变化［2］。派姆单抗可明显改善受PD-L1阳性肿瘤细胞抗原慢性刺激的抗GD2 CAR-T细胞的功能和活性［3］。Chong等［4］曾报道一例难治性弥漫性大 B 细胞淋巴瘤患者在接受抗CD19 CAR T 细胞治疗后肿瘤仍持续进展并显示为PD-L1表达强阳性,该患者在接受CAR-T治疗输注后第26天开始使用派姆单抗,后发现患者体内表达PD-1的T细胞比例开始下降,TCRβ表达升高,T细胞克隆增加,CAR-T细胞输注后的第45天发现患者多处病灶消退。另一项研究证明PD1/PDL1轴阻断可恢复胸膜间皮瘤原位小鼠模型中间皮特异性CAR-T细胞的效应器功能［5］。派姆单抗与CD19特异性CAR-T在儿童急性淋巴白血病中的联合应用可以增强CAR-T细胞在患者外周血中的持久性和产生较低的肿瘤负荷［6］。但应当注意有效的PD1阻断高度依赖于PD1抗体的量,如在给予相对高剂量的PD1抗体(250 μg/小鼠)后,PD1阻断可增强小鼠乳腺癌模型中HER2特异性CAR-T细胞的抗癌活性,而在较低剂量(125 μg/鼠)下未观察到增强作用［7］。

1.2细胞内策略细胞内策略省略了单独给予患者免疫检查点抑制剂的步骤,一定程度上降低了系统性使用免疫检查点抑制剂带来的全身毒性,比细胞外策略更具有研究前景。策略一是改造CAR-T细胞使其自身可持续产生免疫检查点抑制剂,如PD-(L)1抗体。目前已研究出通过用慢病毒感染人原代T细胞使其表达抗PD-L1 scFv抗体的技术,这种技术可以使改造后的T细胞产生PD-L1抗体,增加PD-L1抗体在TME中的浓度从而阻断PD1/PDL1轴。与不表达抗PD-L1 scFv的CAR-T相比,这种抗体的局部递送可以导致肿瘤生长率降低5倍,肿瘤体积减少50%～80%［8］。类似的,Rafiq等［9］改造CAR-T细胞使其表面表达抗PD-1 scFv抗体,增强PD-1抗体在TME中的浓度,有利于CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤。

策略二是使CAR-T细胞表达PD-1负受体使之与正常的T细胞表面PD-1受体竞争PD-L1配体。PD-1负受体与正常的PD-1受体的区别在于,PD-1负受体的胞外结构域与 CD28的跨膜和细胞内结构域融合,因此接受PD-L1信号的PD-1负受体对细胞产生刺激作用而非抑制作用。这种方法可以增强CAR-T细胞的效应功能和在体内的持久性,有证据证明使用PD-1负受体和大量使用PD-1抗体的疗效相似,并且可以降低大量使用PD-1抗体带来的毒性［5］。目前PD-1负受体的疗效仍存在争议,因为有研究证明使用PD-1负受体治疗的小鼠在治疗后一段时间又复发,所以目前PD-1负受体对肿瘤的杀伤作用还在进一步做临床研究中。

策略三是通过降低CAR-T细胞表面抑制性受体的表达,如PD-1、TIM-3 和 LAG-3等来增强CAR-T细胞的效应器功能,目前常用的方法是基因组编辑,如CRISPR/Cas9和TALEN系统等［10］。这种方法的缺点是完全不表达PD-1的CAR-T细胞易向终末期的衰竭T细胞发展,因此在进行基因编辑之前最好上调一定量的PD-1表达。

2 CAR-T联合白细胞介素治疗

白细胞介素可增强CAR-T的抗癌效果,尤其是在实体瘤中,TME由于其缺氧、低营养含量和高浓度代谢产物的特点明显抑制T细胞增殖和其产生促炎细胞因子的能力,因此TME是免疫细胞难以接近和浸润的部位。有研究证明CAR-T治疗联合细胞因子使用或CAR-T细胞共表达细胞因子可以增强CAR-T细胞的持久性,增强杀伤肿瘤细胞的能力,且能抑制实体瘤典型的免疫抑制性TME。对于实体瘤患者,可考虑将白介素制剂与CAR-T细胞一起全身给药,或者改造CAR-T细胞使其组成性或诱导性共表达白介素。然而同时使用CAR-T治疗和白介素治疗时也需要考虑全身细胞因子水平增加等相关副作用,控制对机体产生的毒性。

2.1白细胞介素-2(IL-2)IL-2可维持CD8+ T细胞的生长活性,并增强其在体外和体内对肿瘤细胞的杀伤能力。在动物模型中,IL-2增强了肉瘤和腺癌小鼠体内淋巴因子激活的杀伤细胞(lymphokine-activated killer cell, LAK)的抗肿瘤活性［11］。外源性IL-2对CAR-T疗效具有重要性,在没有IL-2的情况下,第一代或第二代CAR-T细胞都会在6天内死亡［12］。IL-2可使CAR-T细胞在体内的存活时间延长,如局部递送erbB-2特异性CAR-T细胞联合系统使用IL-2治疗前列腺癌异种移植模型可以增强CAR-T细胞的存活率和持久性,进而导致肿瘤完全消除［13］。在用过继性T细胞与高剂量IL-2联合治疗黑色素瘤患者时,实现了50%的临床应答率和13%的持久缓解率,转移性黑色素瘤的完全消退可以持续5年以上［14］。

使用IL-2治疗的毒性不可忽视,IL-2促进免疫细胞的激活从而释放大量促炎细胞因子,与内皮细胞上IL-2Rα受体结合导致毛细血管渗漏综合征。用CD19特异性CAR-T细胞和低剂量重组人IL-2(rhIL-2)治疗难治性滤泡性淋巴瘤时未观察到明显毒性,但最近的临床试验证明低剂量IL-2不足以在最佳反应下维持CAR-T抗癌活性［15-16］。大剂量使用IL-2可增强T细胞的活性和功能,但在靶向卵巢癌相关抗原的CAR-T细胞与高剂量IL-2联合治疗卵巢癌的临床试验中,8名入选患者中有5名患者出现3-4级治疗相关毒性,通过进一步研究高度怀疑该毒性与IL-2相关［17］。因此确定在无严重不良反应的前提下实现实质性疗效的IL-2的最佳剂量极为重要。

2.2IL-7IL-7在效应T细胞向记忆T细胞的转变中起重要作用,通过增强Bcl-2表达促进CD8+T细胞增殖,减少T细胞的凋亡和耗竭,还通过增加低分化CAR-T细胞的表型提高CAR-T细胞的持久性和生存能力［18-19］。IL-7与CAR-T联合施用增加了CAR-T细胞的活化、增殖以及Th1细胞因子分泌和抗肿瘤能力。IL-7可显著富集CAR-T细胞中的CD8+CD45RA+CCR7+(记忆T细胞表型)细胞亚型,并通过增强这类细胞的存活率和持久性产生更大的抗肿瘤活性［20］。Xiong等［21］在肝癌模型中构建了靶向GPC3 且共表达IL-7和透明质酸酶(PH20)的CAR-T细胞,结果表明IL-7与PH20的共表达可明显提高CAR-T细胞对实体瘤的疗效。He等［18］构建了靶向NKG2D且共表达IL-7的CAR-T细胞,使其用于对前列腺癌的治疗,后发现IL-7的产生增强了CAR-T细胞的扩增并抑制其凋亡。Adachi等［22］构建了共表达IL-7和CCL19的CAR-T细胞,并在多个实体瘤中显示出比常规CAR-T细胞更优异的TME浸润和肿瘤杀伤活性。

此外,IL-7受体(C7R/IL-7R)也用于构建基因编辑的CAR-T。最近的一项研究证实,共表达C7R的CAR-T细胞对神经母细胞瘤和胶质母细胞瘤具有显著的抗肿瘤活性［23］。Perna等［24］设计了一种GD2特异性的表达IL-7Rα的CAR-T细胞,在存在IL-7的神经母细胞瘤异种移植物模型中,GD2-IL7Rα-CAR-T实现了消除肿瘤的增强效力。然而对其他类型肿瘤的疗效并非同样出色,Zhao等［25］构建了共表达C7R的CAR-T细胞,在治疗三阴性乳腺癌的临床前实验中显示了良好的体外肿瘤杀伤效果。然而在体内C7R-CAR-T细胞未显示出优于常规CAR-T细胞的任何优势,其结果可能受肿瘤组织中IL-7配体密度的影响。

2.3IL-12IL-12是一种由吞噬细胞和树突状细胞释放的促炎细胞因子,可介导先天免疫和适应性免疫。可将原始CD4+辅助性T细胞极化为Th1表型T细胞,维持CD4+T记忆细胞的存活,促进T细胞和NK细胞的增殖和细胞因子分泌,以及抗血管生成和抗癌细胞转移等。Agliardi等［26］研究发现CAR-T治疗与局部注射IL-12联合治疗多形性胶质母细胞瘤比单独CAR-T治疗可产生更持久的抗肿瘤反应,研究还表明IL-12不仅增强了CAR-T细胞的细胞毒性,还重塑了TME,促进促炎性CD4+T细胞的浸润,并减少了Treg的数量。然而,全身施用IL-12可能导致高水平的干扰素-γ从而对患者产生严重毒性,因此目前限制了IL-12在临床上的大剂量应用。

面对这一挑战,研究人员已成功构建基因编辑的共表达IL-12的CAR-T细胞,以增强CAR-T的抗肿瘤活性,同时减轻系统使用IL-12的副作用,有研究证明与106个无IL-12释放的CAR-T细胞相比,单剂量105个组成性表达IL-12的CAR-T细胞对已建立的肿瘤模型更有效［27］。在体外试验中,与单独的特异性CAR-T细胞相比,经修饰以组成性表达IL-12的MUC16ACTO特异性CAR-T细胞显示出更好的存活率、增殖活性和强大的IFN-γ分泌能力。在具有人卵巢肿瘤异种移植物的免疫缺陷小鼠模型中,分泌IL-12的CAR-T细胞也显示出增加的存活率,延长了CAR-T细胞的体内持久性［28］。Chinnasamy等［29］发现当输注2×107个VEGFR2特异性CAR-T细胞时,血管化肿瘤的增殖被有效抑制,当输注组成性表达IL-12的CAR-T时,只需5×105个VEGFR2 -IL-12-CAR-T细胞就能达到同种效果,且能有效地根除已建立的肿瘤。类似的,Hombach等［30］在结直肠癌的临床前研究中构建了共表达IL-7和IL-12的CAR-T细胞,构建产物IL-7与IL-12可明显增强CAR-T细胞的扩增和持久性。

IL-12武装的CAR-T细胞可能将先天免疫与适应性免疫反应联系起来,来对抗肿瘤及其异质性。Liu等［31］发现共表达IL-12的GPC3特异性CAR-T细胞比单纯靶向GPC3的CAR-T细胞更能裂解GPC3+肿瘤细胞,并分泌更多细胞因子,原因在于IL-12增加了T细胞的浸润和持续性。Kueberuwa等［32］使用表达IL-12的CD19特异性CAR-T细胞治疗B细胞淋巴瘤荷瘤小鼠可以明显提高小鼠的长期存活率。他们还证明,IL12-CD19-CAR-T细胞不仅直接杀死CD19+肿瘤细胞,还招募宿主免疫细胞进行抗癌免疫应答。除此之外,共表达IL-12的CAR-T细胞还能识别免疫逃逸的肿瘤细胞,Chmielewski等［33］发现工程化后的CAR-T诱导IL-2的表达,后者招募巨噬细胞杀死由于肿瘤相关抗原的丢失而不能被CAR-T细胞识别的靶细胞。

过量的IL-12不仅会对宿主产生毒性,还会导致T细胞凋亡,从而限制其扩增［34］。研究表明,当过继转移相同数量的CAR-T细胞时,与组成性IL-12表达相比,诱导型IL-12表达可避免严重毒性［35］。在You等［36］构建的靶向MUC1共表达IL-12的CAR T细胞治疗精囊腺癌的研究中,患者仅在治疗的开始出现轻度头痛、发热、肌肉疼痛、鼻塞和腹胀不适,肿瘤内注射后6～12d,所有不适症状消失,体温恢复正常。肿瘤内注射后检测到瞬时CRS,IL-6增加10倍,TNF-α增加约60%,因此在该临床试验中,在精囊腺癌中使用MUC1-IL-12-CAR-T细胞产生的副作用可以被人体耐受。

2.4IL-15IL-15是IL-2细胞因子家族的成员,与IL-2类似,IL-15可促进NK细胞的活化和增殖,然而,与IL-2不同,IL-15不会导致CD8+效应细胞的活化诱导细胞死亡(activation induced cell death, AICD)和Tregs的扩增,在临床前模型中不会引起毛细血管渗漏综合征［37］。因此,IL-15被认为是肿瘤免疫治疗中T细胞扩增的理想白细胞介素。

与单独使用IL-2相比,使用IL-2和IL-15培养的CAR-T细胞具有更强大的细胞溶解能力。在IL-15支持下的CAR-T细胞在健康捐赠者体内可扩增达765倍,在B细胞恶性肿瘤患者中可扩增180倍［38］。IL-15可显著富集CAR-T细胞中的CD8+CD45RA+CCR7+(记忆T细胞表型)细胞亚型,并通过增强这类细胞对死亡的抗性产生更大的抗肿瘤活性［20］。而且基因编辑的IL-15-CAR-T细胞已被证明在治疗恶性肿瘤方面具有优越性。Lanitis等［39］通过逆转录病毒载体编码共表达IL-15的CAR-T细胞,发现IL-15的共表达不仅增强了CAR-T细胞对肿瘤的浸润和对肿瘤生长的抑制,还改善了免疫抑制性TME,促进NK细胞的活化,减少M2型巨噬细胞的浸润。进一步研究发现,表达IL-15的CAR-T细胞中Bcl-2的表达上调,而PD-1的表达下调。Hoyos等［40］将IL-15和基于caspase-9的自杀基因与抗CD19 CAR-T细胞结合,改造后的CAR-T细胞在体外和体内抗原刺激时均表现出比单纯CD19-CAR-T细胞更大的扩增,在体内表现出更好的抗肿瘤作用,并降低了PD-1的表达。Wang等［41］构建了靶向VEGFR-1且表达 IL-15的CAR-T细胞,相较于单纯的VEGFR-1特异性CAR-T细胞,可明显延迟肿瘤的生长和形成并抑制肺转移。

皮下和腹腔注射重组IL-15均显示出有限的毒性,例如贫血、中性粒细胞减少和体重减轻等,但未出现血管渗漏综合征。一项I期临床试验测试了共表达IL-15的CAR-T细胞在中枢神经系统浸润的难治性淋巴母细胞淋巴瘤患者中的安全性和有效性。在试验中,用IL-15-CD5-CAR-T细胞治疗3周后,患者中枢神经系统压迫症状显著减轻,治疗8周后软组织肿块阴影显著减轻,未出现不可耐受的毒性［42］。目前对于IL-15-CAR-T治疗的安全性研究较少,还需要进行更多试验验证。

2.5IL-18IL-18是一种重要的促炎细胞因子,可激活T细胞的增殖和IFN-γ分泌,可通过增强免疫细胞中Fas配体的表达来促进更有效的肿瘤杀伤。Huang等［43］发现,在免疫缺陷和免疫耐受小鼠中,外源性IL-18可同时在体外和体内提高HER2特异性CAR-T细胞的抗肿瘤功能。共表达IL-18的CAR-T细胞可以显著增强CAR-T细胞的抗肿瘤活性。Hu等［44］利用转基因技术构建了靶向CD19共表达IL18的CAR-T细胞,发现在体内CD19-IL-18 CAR-T细胞显著增强了CAR-T细胞的增殖,有效增强黑色素瘤小鼠的抗肿瘤疗效。此外Chmielewski等［45］发现共表达IL-18的CAR-T细胞的抗肿瘤过程可以改变TME,如M1型巨噬细胞和NK细胞数量增加,而Treg、抑制性DC和M2型巨噬细胞数量减少,表明IL-18具有招募外周免疫细胞抗肿瘤的功能。目前关于IL-18-CAR-T细胞的毒性的研究结果较少,宾夕法尼亚大学团队目前正在进行一项针对CD-19的共表达IL-18 CAR-T细胞治疗淋巴瘤的临床试验(NCT04684563),此研究的主要目的是评估CD19-IL-18-CAR-T治疗的最大安全剂量。

2.6IL-21IL-21主要由T细胞和自然杀伤T细胞(natural killer T cell, NKT)产生,可提高CD8+T细胞的活性,抑制Treg的生成,最近一项关于胰腺癌的研究发现,IL-21还可通过增强NK细胞功能产生抗肿瘤作用［46］。IL-21因其积极调节肿瘤相关免疫细胞的能力而被用于CAR-T的研究。外源性IL-21通过增强低分化CAR-T细胞的富集和扩增,提高了CAR-T细胞的杀伤作用。在小鼠模型中组成性分泌IL-21的CD19特异性CAR-T细胞存活时间延长,并且较单纯靶向CD19的CAR-T细胞具备更强的抗肿瘤能力,表现出改善的功能和记忆表型。而且基因编辑产物IL-21促进CD19-IL-21-CAR-T细胞的肿瘤浸润,导致肿瘤生长迟缓［47］。目前正在进行一项在多个实体瘤(NCT04715191)中应用靶向GPC3共表达IL-15和IL-21的CAR-T细胞治疗的临床试验,此研究的目的是确定GPC3-IL-15/IL-21-CAR-T细胞的最大安全剂量,并确定其在体内的疗效和副作用。

2.7IL-23IL-23属于IL-12家族,由IL-23 p19和IL-12 p40组成,促进记忆T细胞的增殖,尤其是表达IL-23R的Th17细胞。目前关于基因编辑的IL-23 CAR-T细胞的研究相对较少,但已完成的研究取得较明显的结果。Wang等［48］发现靶向前列腺特异性膜抗原(prostate-specific membrane antigen, PSMA)且共表达IL-23的CAR-T细胞,在体外的增殖能力和细胞因子分泌能力显著高于常规CAR-T细胞,共表达IL-23的CAR-T细胞在体内也显示出更高的肿瘤清除率和更快的体重恢复。研究人员构建了共表达IL-12 p40亚单位的CAR-T细胞,并发现CAR-T细胞通过IL-23信号通路获得选择性增殖活性,与常规CAR-T细胞相比,p40-CAR-T细胞显示出优越的抗肿瘤活性。p40-CAR-T细胞在荷瘤小鼠异种移植中的治疗效果优于常规CAR-T细胞。更重要的是,在体内试验中,共表达IL-23的CAR-T细胞与共表达其他白介素的CAR-T细胞相比,显示出更少的不良反应［49］。

3 结语与展望

基于CAR-T细胞的过继免疫治疗已被证明是治疗血液系统恶性肿瘤的一种有前景的策略。然而,这一临床成功在实体瘤中尚未完全实现,主要是因为实体瘤的免疫抑制性TME限制了CAR-T细胞的增殖和持久性,损害CAR-T细胞的杀伤肿瘤的功能［50-51］。在各种增强CAR-T细胞功能和活性的策略中,CAR-T联合免疫检查点抑制剂和白细胞介素是其中较有潜力的选择,但是目前仍未十分成熟,还需进一步研究。同时我们也需要深入考虑,免疫检查点抑制剂和白细胞介素是否对CAR-T细胞具有协同强化作用,两药联合使用能否在毒性可控的前提下给患者带来更好的临床获益。在通过药物联合或者基因编辑CAR-T增强CAR-T疗效时,我们应该明确在哪些肿瘤类型中免疫检查点抑制剂或白介素治疗与CAR-T起协同作用,也要兼顾治疗带来的毒性,确定治疗的最大安全剂量,以期给患者带来更好的临床缓解和更长的生存时间。