外泌体在变应性鼻炎中的研究进展

张 芳,刘 海综述,张建辉审校

0 引 言

变应性鼻炎(allergic rhinitis,AR)是特应性个体接触变应原后发生在鼻黏膜的非感染性炎症性疾病,典型的症状包括鼻痒、鼻阻、流涕、阵发性打喷嚏［1］。虽然AR对生命威胁不大,但其降低患者生活质量,增加经济负担［1］,同时还是支气管哮喘的诱发因素之一。外泌体是可由多种细胞分泌的脂质囊泡,存在于多种体液中,包括血液、尿液、鼻腔灌洗液(nasal lavage fluid,NLF)等。近年来,研究发现外泌体参与多种生理和病理过程［2］。随着在NLF中分离出外泌体［3］,外泌体被认为在AR的发生发展中具有重要作用,可能为AR诊断及治疗提供一种新方式。本文就外泌体在AR中的作用和诊断治疗方面的研究进展进行综述。

1 外泌体

1.1 外泌体的来源及结构1983年,Harding等［4］和Pan等［5］在研究成熟网织红细胞转铁蛋白受体(transferrin receptor,TfR)清除过程中发现,TfR被选择性内吞,然后包裹在囊泡中随囊泡分泌到胞外。后面才将这种分泌到细胞外的小囊泡命名为外泌体。外泌体是与细胞具有相似结构的小囊泡,大小30～200 nm不等,密度1.1～1.2 g/mL［6］,其富含蛋白质、核酸及脂类等信号分子。与母细胞相比,外泌体外膜的脂类构成有所差别,富含鞘磷脂可能使外泌体的硬度增加,使其更不易在运输中被破坏［7］。

1.2外泌体的分泌外泌体在细胞内体中形成,细胞膜内陷后形成内吞囊泡,随后内吞囊泡融合形成核内体,形成的核内体进一步成熟为多泡体(multivesicular endosomes or bodies,MVBs),MVBs中包含许多腔内囊泡(ILVs)［8-9］。这些MVBs与细胞膜融合后释放ILVs至细胞外,这些ILVs即是外泌体。

1.3外泌体的分离与鉴定分离和纯化外泌体的效果直接影响后续对其进一步的研究。超速离心法是目前应用最广泛的分离外泌体的方法［10-11］,此外,还有超滤法、尺寸排阻色谱法、聚合物沉淀法及免疫亲和捕获法［10- 12］,也有将多种分离方法结合的分离方式。应用多种方式结合分离纯化可降低外泌体的中污染蛋白的含量,但同时也伴随着外泌体回收率的降低［13］。故对于回收率和纯度,研究者应根据后续研究内容选择合适的分离方法。

目前对外泌体的鉴定主要是对其形态、粒径及表面标志物进行分析。蛋白质印迹法、纳米颗粒追踪分析及电子显微镜是常用的鉴定方法［10］。根据外泌体所有的标志物,如CD9、CD63、CD81、Alix、TSG101等,不仅可以用来鉴定外泌体,其膜上含量丰富的四跨膜蛋白还可以作为表面信号分子,具有向受体细胞传递功能受体和信号转导的作用［6, 14］。

2 外泌体在AR中的作用

2.1 细胞间通讯外泌体由于其特殊的脂质双分子层结构,远距离运输时不易被破坏［15］,通过在细胞间传递生物信息而被认为参与细胞间通讯。当被受体细胞识别后,外泌体与受体细胞膜融合或被受体细胞内吞入细胞内,释放生物学信号(如蛋白质、核酸等),进而引起受体细胞生物学功能变化［16-17］。外泌体与受体细胞的识别可能与外泌体表面富集的蛋白质和受体细胞膜上的受体有关,介导这种特异性识别的分子包括四跨膜蛋白、整合素、脂质、凝集素、硫酸乙酰肝素蛋白多糖和细胞外基质,整合素和四跨膜蛋白在外泌体与受体细胞识别结合过程中发挥重要作用［18］;当外泌体被内吞至细胞内后,外泌体可沿内吞途径到达MVBs,通过与MVBs膜反向融合而躲避消化,从而在受体细胞内释放生物信号分子［18］。外泌体表面的四跨膜蛋白还与MHC分子的聚集程度有关,以诱导免疫反应［19］。

miRNA是一类高度保守的内源性非编码小RNA,长度约22 个核苷酸,其通过与目的mRNA 3＇非翻译区结合而抑制mRNA翻译为蛋白质,参与生理和病理过程中转录后基因表达调控。多项研究证明,miRNA可被外泌体转移至受体细胞并调节受体细胞的基因表达［20-22］。AR患者和正常健康者的NLF相比,外泌体中有多个miRNA表达存在差异,其中21个miRNA表达上调,14个miRNA表达下调,表达显著增加的miR-30-5p 、miR-199b-3p和显著降低的miR-874 、miR-28-3p被认为参与B细胞受体信号通路［23］。在HDM致敏小鼠的哮喘模型中,支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中的外泌体的部分miRNA表达增强, 其中miR-346被认为高度与IL-13有关,而IL-13是气道过敏性炎症中重要的炎症因子,表明在气道的过敏性炎症中,与Th2反应有关的miRNA被分选进入外泌体,再通过外泌体分泌入气道进而促进过敏性气道炎症的发展［24］。这些与过敏性气道炎症相关的miRNA可能通过外泌体传递至受体细胞而被识别,从而调控受体细胞基因表达,进而影响AR病程的进展。

LncRNA是一类长度大于 200 个核苷酸的非编码 RNA。研究还发现外泌体中LncRNA也参与AR的炎症反应。Wang等［25］发现AR患者中,LncRNA NEAT1通过外泌体的传递参与到miR-511/NR4A2 通路中,从而促进黏液及炎症性细胞因子的分泌,进而影响炎症的进展。

2.2调节免疫反应AR的主要特征是Th1/Th2细胞免疫失衡,同时存在调节性T细胞(Treg细胞)的缺陷。外泌体可通过与受体细胞相互作用,参与细胞免疫失衡并促进AR炎症的发展。AR患者血浆中外泌体浓度较正常对照组更高,可能与机体炎症状态有关［26］。Zhu等［27］发现AR患者的NLF来源和卵清白蛋白刺激后的鼻腔黏膜上皮来源的外泌体均表达Lnc GAS5,进一步研究发现Lnc GAS5通过下调EZH2、T-bet而调控CD+4 T细胞分化,促进Th2分化同时抑制Th1细胞分化,提示外泌体参与调节Th1/Th2细胞免疫平衡,促进过敏性炎症的发展。Fang等［28］发现AR患者血浆外泌体与CD4+T细胞相互作用后也能诱导Th2细胞分化。研究还发现IL-13致敏的气道上皮细胞分泌的外泌体可以直接诱导炎症细胞(单核细胞)增殖,还可以增加BALF中炎症因子水平(如IL-4、IL-5、IL-13)从而增强气道炎症反应,而在应用外泌体抑制剂后上述炎症细胞及炎症因子水平均降低［29］。AR主要是Th2细胞的免疫反应偏移引起炎性细胞因子及炎症介质释放而导致的炎症反应,上述结果均表明AR中的外泌体参与到过敏性气道炎症的调节中,其能诱导Th2细胞分化,进而影响炎症介质的水平,决定AR的发展进程。

此外,研究还发现,miR-146a在AR患者鼻黏膜及鼻黏膜上皮细胞分泌的外泌体中均低表达,将携带miR-146a的外泌体与单核细胞共培养时,其能诱导单核细胞产生IL-10［30］;在进一步的动物实验中,用含miR-146a外泌体刺激后的单核细胞或直接鼻腔滴入含miR-146a的外泌体干预AR小鼠模型后,发现Th2细胞分化被抑制,血清特异性IgE和相关Th2型细胞因子(IL-4、IL-5、IL-13)也相应减少［30］,提示外泌体中的miR-146a可以通过诱导单核细胞产生IL-10而进一步对AR Th2型免疫反应起抑制作用。后来,Li等［31］研究还发现miR-146a-5p可以通过下调Smad3的表达,减少Smad3/GATA-3复合体的形成,进而促进CD4+T细胞向Th1分化,从而抑制AR的进展。

2.3抗原提呈抗原提呈细胞(antigen presenting cells,APCs)表面的抗原肽MHC复合物和共刺激分子被T细胞识别后,APCs把抗原肽MHC复合物传递给T细胞,并活化T细胞。免疫细胞及非免疫细胞产生的外泌体均可以在免疫反应中发挥作用,能呈递抗原并活化免疫细胞［2］。几乎所有细胞分泌的外泌体均表达MHC I类分子,并可活化CD8+T细胞［32］。APCs分泌的外泌体均表达MHC II类分子,且能将MHC II抗原肽复合物呈递给CD4+T细胞［33］。研究发现AR患者NLF外泌体和血液外泌体都表达HLA-DR(MHC II类分子)［23, 28］,并且重度AR患者血液外泌体还表达Der p 1抗原［28］,表明在AR的发展过程中,外泌体可能参与抗原呈递的作用。

3 外泌体在AR诊断和治疗中的作用

miRNA可以稳定存在于外泌体中,且易于被检测,故外泌体中的miRNA常作为疾病的生物标志物。如肺癌患者血液外泌体中miR-96可以作为诊断肺癌的生物标志物［34］。还有研究发现哮喘患者血液外泌体中miR-122-5p水平明显高于正常对照组,并与血液中嗜酸性粒细胞和中性粒细胞数呈正比［35］,提示其可能是诊断哮喘的生物标志物。未来也有望在AR的外泌体中寻找出相关诊断及分型的标志物。

间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一种可分化成多种细胞类型的多能干细胞,具有强大的免疫调节功能,可以调节CD4+T细胞分化,维持CD4+T细胞亚群之间的平衡,从而在维持免疫稳态中发挥重要作用。外泌体的特性与来源细胞相关。在多种疾病模型中,间充质干细胞分泌的外泌体被认为与母细胞具有相似甚至更好的治疗效果［36］。研究发现,MSCs外泌体与CD4+T细胞共培养后,Th2细胞数量减少,炎症因子(如IL-4、IL-13)的水平降低,表明MSCs外泌体可以抑制Th2分化［37-38］。Fang等［39］还发现MSCs外泌体还可以通过传递miR-146a-5p抑制以2型固有淋巴细胞为主的过敏性气道炎症。此外,在动物实验中的研究发现,MSCs的外泌体可减少Th17细胞,增加Treg细胞,改善炎症中Th17 /Treg细胞平衡,参与免疫调节［40-42］。最近的一项研究发现,携带CpG DNA和OVA的人胚胎肾细胞来源的外泌体能被树突状细胞摄取并激活树突状细胞,将其干预AR小鼠模型时,发现其进入鼻黏膜的鼻咽相关淋巴液组织中并被树突状细胞摄取,相对于对照组,其可以诱导Th1免疫反应,并明显减轻AR的症状和减少血清中IgE的含量［43］。因此,间充质干细胞分泌的外泌体可以使AR中Th2应答向Th1应答转化,并能调节Treg细胞的功能,从而实现抑制免疫反应,纠正AR中Th1/Th2细胞免疫失衡,可能为AR的治疗提供新的思路。

4 结 语

近年来,外泌体的生物学研究取得了一定的进展,外泌体在AR的病理过程中扮演着重要的角色。由于多种细胞均可分泌外泌体,故目前对特定体液中的外泌体还难以进行特征性描述。在治疗方面,MSCs来源的外泌体具有免疫原性低、生物安全性较高的优点,有较大的治疗潜力,但需要更多体内模型来证实外泌体治疗AR的可行性。针对外泌体在AR中的作用机制继续深入研究,将有助于为AR诊断和治疗提供新的思路。利用外泌体对免疫反应的调节,外泌体也有望成为AR治疗的一种新方式。