Th9细胞及IL-9在嗜酸细胞性胃肠炎发病机制中的作用

朱 航,金 玉

0 引 言

嗜酸细胞性胃肠炎(eosinophilic gastroenteritis,EG)是一种以胃肠道黏膜局限性或弥漫性嗜酸性粒细胞(eosinophils,EO)异常增高、浸润为特征的疾病,可累及整个胃肠道,儿童和成人均可发病。EG的发病机制目前尚不明确,目前认为:嗜酸性粒细胞活化后在炎症部位聚集,释放多种细胞毒性物质,损伤肠黏膜上皮细胞,破坏细胞间连接,使肠道炎症反应进一步发展。既往研究发现紧密连接蛋白表达或定位的改变会增加细菌及其产物进入固有层的风险,可能引发不恰当的免疫反应［2］。

Th9细胞在过敏性疾病中扮演着重要的角色［3-4］。研究发现,与健康人群相比,患有过敏性疾病的儿童和成人外周血中Th9细胞数量增多,IL-9水平显著升高,且与血清总IgE水平呈正相关［5-7］。Barros KV等［8］发现,牛奶蛋白过敏患儿的血浆中IL-9浓度与外周血嗜酸性粒细胞数量呈正相关,回避牛奶蛋白后血浆IL-9浓度可明显下降。而IL-9能促进嗜酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)发挥趋化作用,使嗜酸性粒细胞和肥大细胞聚集,促进粘液生成、胶原沉积和Th2型细胞因子的释放,推动哮喘的发展［9-12］。本研究通过检测EG患儿结肠黏膜中Th9细胞、IL-9及各种细胞间连接蛋白的表达水平,探讨Th9细胞在儿童EG发病中的可能作用。

1 资料与方法

1.1 研究对象选取2017年9月至2019年10月在南京医科大学附属儿童医院消化科住院,参照Talley标准［13］诊断为EG的20例患儿为EG组。纳入标准:①有腹痛、腹泻、便血、呕吐等胃肠道症状;②肠黏膜活检病理证实大量嗜酸性粒细胞浸润(≥20个/HPF);③胃肠道以外器官无嗜酸性粒细胞浸润;④排除寄生虫感染、嗜酸性粒细胞增多症、炎症性肠病、过敏性紫癜、嗜酸性肉芽肿、胃肠道肿瘤及恶性淋巴瘤、结缔组织病等可引起胃肠道嗜酸性粒细胞浸润的疾病。选取同期20例以腹痛、腹泻、便血、呕吐等胃肠道症状为主诉,肠黏膜活检病理示EO<10个/HPF,排外EG诊断的患儿为对照组。本研究经南京儿童医院伦理委员会审批通过(批号: 201701015),患者均签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1 收集资料询问病史,收集患儿的一般情况(姓名、性别、年龄等)及临床表现。

1.2.2全血细胞分析及血清总IgE检测留取患儿静脉血3 mL,行全血细胞分析检测嗜酸性粒细胞绝对值及嗜酸性粒细胞百分比,并检测血清总IgE水平。

1.2.3留取结肠粘膜组织两组患儿均按照常规流程采用OLYMPUS LUCERA CV-260进行全结肠镜检查,主要观察两组患儿肠黏膜颜色及血管纹理,有无充血、水肿、溃疡、糜烂、息肉等异常情况,并留取患儿的结肠黏膜组织各3块(每块约2 mm*2 mm)。

1.2.4HE染色和免疫荧光将2块结肠黏膜组织置于4%的多聚甲醛中固定,并进行HE染色和Th9细胞免疫荧光检测。抗CD4抗体标记为绿色,抗PU.1抗体标记为红色,在荧光显微镜下观察,同时标记有抗CD4抗体和抗PU.1抗体的细胞显示为黄色,即为Th9细胞。

1.2.5检测细胞间连接蛋白表达水平将1块结肠粘膜组织置于TRIzol中,提取总RNA,用RT-PCR法检测IL-9、PU.1、STAT3、S100A8、S100A9、Claudin-2、Claudin-3、Occludin、E-钙粘蛋白和β-连环蛋白的mRNA表达水平。

2 结 果

2.1 一般情况EG组20例患儿中男16例,女4例,年龄平均为(8.53±3.30)岁;对照组20例患儿中男15例,女5例,年龄平均为(8.09±4.30)岁。两组患儿性别与年龄的差异均无统计学意义(P>0.05),具有可比性。

2.2临床表现两组患儿临床上均主要表现为腹痛,其次为便血、腹泻和呕吐。EG组与对照组患儿不同临床症状比较无统计学差异(P>0.05),见表1。

表 1 EG组和对照组患儿不同临床症状比较［n(%)］

2.3实验室检查结果EG组20例患儿中,11例EO绝对值升高,最高可达23.65×109/L,平均为(3.14±6.31)×109/L;对照组20例患儿中,2例EO绝对值升高,最高为0.75×109/L,平均为(0.26±0.21)×109/L。两组患儿EO绝对值的差异有统计学意义(P<0.05)。

EG组17例患儿行血清总IgE水平测定,其中10例血清总IgE水平升高,最高可达1139 IU/mL,平均为(389.91±421.78)IU/mL;对照组中15例患儿行血清总IgE水平测定,其中5例血清总IgE水平升高,最高为374.7 IU/mL,平均为(77.87±104.77)IU/mL。两组患儿血清总IgE水平差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4结肠镜和病理结果EG组20例患儿中,55%(11例)患儿肠黏膜正常,其余患儿有充血、水肿、糜烂和/或溃疡等表现。对照20例患儿中,25%(5例)患儿肠黏膜正常,其余可表现为充血、水肿、糜烂和(或)溃疡等,见表2。

EG组患儿结肠黏膜中浸润的EO数量平均为(48.50±47.13)个/HPF,最高可达200个/HPF;对照组患儿结肠黏膜中浸润的EO数量平均为(4.21±4.49)个/HPF,两组间EO密度的差异有统计学意义(P<0.001)。

表 2 EG组和对照组患儿结肠镜结果比较［n(%)］

2.5结肠黏膜中Th9细胞免疫荧光结果荧光显微镜下观察,同时标记有抗CD4抗体和抗PU.1抗体的细胞显示为黄色,即为Th9细胞。EG组患儿的结肠黏膜中可见较多Th9细胞,对照组患儿的结肠黏膜中未见Th9细胞,见图1。

图 1 EG组和对照组患儿结肠黏膜中Th9细胞免疫荧光结果

2.6结肠黏膜中各项指标的表达量EG组患儿的结肠黏膜组织中,IL-9、PU.1、STAT3、S100A8、Claudin-2的mRNA表达量(7.09±12.27、2.61±2.56、1.88±0.94、7.71±12.82、4.85±7.97)较对照组(0.74±0.94、1.34±1.10、1.22±0.83、1.01±1.40、0.96±1.03)明显升高(P<0.05);Claudin-3、Occludin、E-钙粘蛋白和β-连环蛋白的mRNA表达量(0.90±0.95、1.00±0.90、0.75±0.48、0.96±0.82)较对照组(2.45±1.63、1.92±0.98、2.01±1.79、2.97±3.50)明显降低(P<0.05)。EG组和对照组结肠黏膜组织中S100A9 mRNA的表达量(4.71±8.29、1.71±2.52)差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001

2.7各项指标间相关性分析EG组患儿结肠黏膜组织中IL-9的mRNA表达量与STAT3、Claudin-2、S100A9的mRNA表达量及结肠黏膜中EO密度均呈明显正相关(rs=0.351、0.903、0.450、0.654,P<0.05),S100A8的mRNA表达量与结肠黏膜中EO密度呈明显正相关(rs=0.521,P<0.001)。

3 讨 论

PU.1是Th9细胞分化过程中最重要、最特异的转录因子,不仅能调控Il9基因的转录、影响Th9细胞表型相关的组蛋白修饰,还能直接与Il9基因的启动子结合,促进IL-9的产生［14-17］。Hoppenot D等［18］研究发现,哮喘患者外周血中Th9细胞数量增多,PU.1与IL-9水平升高,且IL-9浓度与嗜酸性粒细胞凋亡水平呈负相关。食物过敏患者的十二指肠中,Il9基因的表达显著高于健康人群［19］。嗜酸细胞性食管炎活动期患者的食管内,表达IL-9的嗜酸性粒细胞增多［20］。IL-9影响孔道蛋白的表达,招募肥大细胞在局部聚集,使肠黏膜通透性增加,扩大炎症反应,造成肠上皮细胞的损伤［21-22］。

本研究发现与对照组相比,EG组患儿结肠黏膜中Th9细胞数量增多, IL-9及PU.1的mRNA表达量明显升高,且IL-9的mRNA表达量与结肠黏膜中EO密度呈正相关,推测PU.1在结肠黏膜中高表达,促进初始CD4+T细胞分化为Th9细胞,并分泌大量IL-9,招募嗜酸性粒细胞在炎症局部聚集。

STAT3是多种细胞类型和发育阶段的关键信号分子。 Neufert C等［23］发现健康人群的肠上皮和固有层中,几乎没有pSTAT3,而溃疡性结肠炎活动期患者肠上皮和固有层细胞中pSTAT3水平升高,诱导regIIIβ,regIII,birc5,pla2g5,smo,myc,mcl1等基因的转录,通过抗凋亡、促增值、抑制细菌生长等方式,促进肠黏膜的愈合。本研究发现EG组患儿结肠黏膜STAT3的mRNA表达量显著高于对照组(P<0.05),且与IL-9的mRNA表达量呈明显正相关,推测在EG的发病过程中, IL-9激活了JAK/STAT3信号通路,诱导了下游基因的转录。

S100A8和S100A9通常以Ca2+依赖的方式结合成异源二聚体,即钙卫蛋白。既往研究发现嗜酸性粒细胞在结肠炎症部位的聚集与钙卫蛋白的浓度有关［24］。本研究发现EG组患儿结肠黏膜S100A8的mRNA表达量显著高于对照组(P<0.05),说明EG患儿的结肠黏膜中存在活动性炎症反应。

Claudin蛋白家族和Occludin 蛋白是肠道疾病中被广泛研究的紧密连接蛋白。Tian L等［25］研究发现,在溃疡性结肠炎患者中,IL-9使结肠上皮细胞中Claudin-2蛋白表达增多,Claudin-3蛋白和Occludin蛋白表达减少。Gerlach K等［26］通过结肠炎小鼠模型发现,IL-9通过增加Claudin-2蛋白的表达使肠道通透性增加;而IL-9缺乏时,小鼠肠道固有层中Th9细胞明显减少,结肠炎症状减轻。

经典钙粘蛋白家族和连环蛋白家族是最重要的两种桥粒连接。Doshi A等［27］研究发现嗜酸细胞性食管炎活动期患者E-钙粘蛋白表达减少,且人食管上皮细胞在体外经IL-9刺激后E-钙粘蛋白表达也减少。哮喘患者和慢性哮喘小鼠的β-连环蛋白表达上调,封闭β-连环蛋白的表达可以减少呼吸道上皮纤维化和平滑肌增生,降低气道重构的风险［28］。

本研究发现EG组患儿结肠黏膜中Claudin-2的mRNA表达量显著高于对照组(P<0.05),Claudin-3、Occludin、E-钙粘蛋白及β-连环蛋白的mRNA表达量显著低于对照组(P<0.05),且IL-9与Claudin-2的mRNA表达量呈明显正相关,推测IL-9可能改变细胞间连接蛋白,尤其是Claudin-2蛋白的表达,增加肠壁通透性,减少细胞间的相互黏附力,破坏了肠道的屏障功能。

综上所述,本研究结果显示嗜酸细胞性胃肠炎患儿结肠黏膜中Th9细胞增多,并分泌大量IL-9,影响结肠黏膜中细胞间连接蛋白的表达,使肠黏膜通透性改变,引发一系列的临床表现。